Nichtinvasive Störung des Blutes

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 806 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Weißbüschelaffe (Callithrix jacchus) ist aufgrund seiner geringen Größe, einfachen Handhabung, schnellen Fortpflanzung und seiner gemeinsamen funktionellen und strukturellen Gehirnmerkmale mit Primaten der Alten Welt eine Art, die in den Neurowissenschaften zunehmend an Bedeutung gewinnt. Angesichts der zunehmenden Aufmerksamkeit, die der Modellierung von Erkrankungen des menschlichen Gehirns bei Weißbüschelaffen gewidmet wird, ist es von großer präklinischer Bedeutung zu verstehen, wie therapeutische oder neurotrope Wirkstoffe nichtinvasiv an das Gehirn von Weißbüschelaffen abgegeben werden können. Bei anderen Lebewesen, darunter auch beim Menschen, hat sich transkraniell fokussierter Ultraschall (tFUS) mit Hilfe intravenös injizierter Mikrobläschen als vorübergehende, zuverlässige und sichere Methode zur Störung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​erwiesen, die den fokalen Durchgang therapeutischer Wirkstoffe ermöglicht Andernfalls können sie die engen Endothelverbindungen der BHS nicht ohne weiteres passieren. Die kritische Lücke, die wir hier schließen, besteht darin, Parameter zu dokumentieren, um die BHS bei Weißbüschelaffen mithilfe von tFUS zuverlässig und sicher zu stören. Durch die Integration unserer Gehirnatlanten von Weißbüschelaffen und den Einsatz eines für Weißbüschelaffen spezifischen stereotaktischen Zielsystems führen wir eine Reihe systematischer transkranieller Ultraschallexperimente bei neun Weißbüschelaffen durch. Wir demonstrieren die Auswirkungen von Mittenfrequenz, Schalldruck, Burst-Periode und -Dauer, legen eine minimale Mikrobläschendosis fest, schätzen die Mikrobläschen-Clearance-Zeit ab und schätzen die Dauer ab, die die BHS für den Durchgang offen bleibt. Über eine erfolgreiche Zerstörung der Blut-Hirn-Schranke wird in vivo mit MRT-basierten Kontrastmitteln berichtet, außerdem wurde die Evans-Blau-Färbung ex vivo beurteilt. Histologie (Hämatoxylin- und Eosin-Färbung) und Immunhistochemie weisen darauf hin, dass die BHS mit den aus diesen Experimenten abgeleiteten Parametern sicher und zuverlässig geöffnet werden kann. Die hier vorgestellte Versuchsreihe etabliert Methoden zur sicheren, reproduzierbaren und fokalen Störung der BHS mithilfe von tFUS beim Weißbüschelaffen, die als Grundlage für die nichtinvasive Verabreichung therapeutischer oder neurotroper Wirkstoffe dienen können.

Der Schwerpunkt dieses Manuskripts liegt auf der Festlegung von Parametern zur sicheren Störung der Blut-Hirn-Schranke (BBB) ​​beim Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus), einer Art, die in den Neurowissenschaften zunehmend an Bedeutung gewinnt. Die BHS reguliert die Permeabilität von Molekülen zum Hirnparenchym, das aus Kapillarendothel besteht und das Eindringen von Molekülen mit einem Gewicht von ca. 400 Da verhindert1. Bei anderen präklinischen Modelltierarten (z. B. Ratten, Mäuse, Makaken, Kaninchen, Schweine) hat sich der transkranielle fokussierte Ultraschall (tFUS) zu einem zuverlässigen Mittel entwickelt, um invasive intrazerebrale Injektionen zu umgehen und eine Wirkstoffabgabe durch vorübergehende Störung der Blut-Hirn-Schranke zu ermöglichen2,3,4, 5,6,7,8,9. Der Wert der Anwendung von tFUS zur nichtinvasiven und lokalen Störung der Blut-Hirn-Schranke im Weißbüschelaffen-Modell ist möglicherweise enorm – beispielsweise kann tFUS durch Ausnutzung des kurzen Zwischengeburtsintervalls und der relativ kurzen Lebensdauer des Weißbüschelaffens als longitudinale und nichtinvasive Methode der Neuromodulation eingesetzt werden10, neuronale Verfolgung11,12 oder sogar fokale Arzneimittelabgabe13 für ein Krankheitsmodell über die gesamte Lebensspanne. Mit einem lissenzephalen Kortex und einer kortikalen Architektur, die denen von Menschen ähnlicher ist als denen von Nagetieren14,15,16,17, sind Weißbüschelaffen ideal für tFUS, da sie im Vergleich zu den stark gefalteten Gehirnen anderer Primatenarten eine einfachere Ausrichtung über den Kortex ermöglichen.

Die hier angesprochene kritische Lücke besteht darin, die Fähigkeit zu dokumentieren, die Blut-Hirn-Schranke im Weißbüschelaffen mithilfe von tFUS mithilfe von Mikrobläschenkavitation zuverlässig und nichtinvasiv zu öffnen. Mikrobläschen sind mikroskopisch kleine (~1–10 μm) gasgefüllte Mizellen, die unmittelbar vor der Ultraschallstimulation systemisch injiziert werden können18. Bei niedrigeren Schalldrücken oszillieren Mikrobläschen (stabile Kavitation) und können bei ausreichendem Druck kollabieren (Trägheitskavitation) und einen starken Flüssigkeitsstrahl durch das Endothel freisetzen, der die Wirkstoffabgabe verstärken kann18,19,20. Da sich gezeigt hat, dass unzählige verfügbare neuromodulatorische oder therapeutische Wirkstoffe die Blut-Hirn-Schranke aufgrund der ultraschallvermittelten Mikrobläschen-Kavitation13,21,22,23 durchqueren, wird das Verständnis der Parameter zum Öffnen der Blut-Hirn-Schranke im Weißbüschelaffen unweigerlich zu zahlreichen neurowissenschaftlichen Anwendungen führen. Wir gehen davon aus, dass diese Technik breite Anwendung in der translationalen Weißbüschelaffenforschung finden wird, insbesondere für neurologische Entwicklungsanwendungen, und eine Möglichkeit bietet, die neuropathologische Entstehung von Schaltkreisstörungen bereits in jungen Jahren nichtinvasiv zu verfolgen.

Durch die Kombination eines Weißbüschelaffen-spezifischen Atlas (zytoarchitektonische Grenzen registriert24 im MRT-Raum25,26) und eines jetzt im Handel erhältlichen Weißbüschelaffen-spezifischen fokussierten Ultraschallgeräts (Abb. 1; RK-50 Marmoset, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Kanada) Wir demonstrieren die erforderlichen Parameter, um die BHS mit einem Einzelelement-1,46-MHz-Wandler zuverlässig stereotaktisch anzuvisieren und auf ein kleines Parenchymvolumen (~10–20 mm3) zu öffnen. Wir demonstrieren die Auswirkungen der Mittenfrequenz auf die Größe der BHS-Störung, die akustische Dämpfung durch den Weißbüschelaffenschädel, den minimalen Schalldruck zur Störung der BHS und die schädlichen Auswirkungen von zu viel Schalldruck. Wir demonstrieren außerdem die minimale Mikrobläschendosis für eine BHS-Störung bei sicherem Schalldruck, schätzen die Mikrobläschen-Beseitigungszeit und die Auswirkung des Schädelwinkels auf die BHS-Störung. Durch die Berichterstattung mittels In-vivo-Gadolinium-verstärkter MRT und Ex-vivo-Evans-Blue-Färbung sowie histologischer und immunhistochemischer Berichterstattung liefern wir eine detaillierte Darstellung der erforderlichen Parameter für eine sichere, reproduzierbare und fokale Störung der BHS beim Weißbüschelaffen.

a Computergestütztes dreidimensionales Rendering der stereotaktischen Positionierung des Weißbüschelaffen in Bezug auf den Wandler und das Hydrophon. b Software MORPHEUS (FUS Instruments, Toronto, Ontario, Kanada) mit unseren Krallenaffen-Atlanten zusammen mit zytoarchitektonischen Grenzen integriert. c Relative Größe der BHS-Störung unter Verwendung eines 515-kHz- und 1,46-MHz-Wandlers, überlagert auf dem Weißbüschelaffen-Atlas. d Relative Größe der BHS-Störung, wie durch Evans-Blau-Färbung in Marmoset B berichtet.

Basierend auf der CT-Bildgebung der geschmolzenen Acryl-Testplatte haben wir den euklidischen Abstand von jedem Beschallungspunkt zum Zielort quantifiziert. Ergänzende Abbildung 1g zeigt die Genauigkeit über die 24 einzelnen Beschallungspunkte in der XY-Ebene. Der durchschnittliche räumliche Fehler betrug 220 μm in X-Richtung, 117 μm in Y-Richtung und 247 μm in Z-Richtung.

Weißbüschelaffe B erhielt zwei Ultraschallbehandlungen im parietalen Kortex, um den relativen Unterschied in der Größe der BHS-Störung als Funktion der Mittenfrequenz des Wandlers zu bestimmen. Mit dem Ziel, die Größe der Störung zu minimieren, wurden beide Wandler (515 kHz, linke Hemisphäre; 1,46 MHz, rechte Hemisphäre) auf den Rand der Kortikalis fokussiert (Abb. 1c) – folglich nur etwa die Hälfte des Ultraschallstrahls im Die axiale Ausrichtung konzentrierte sich auf Gehirngewebe. Wie aus der Evans-Blau-Färbung hervorgeht (Abb. 1d), lagen beide Beschallungen im Volumen nahe bei der vollen Breite des Halbmaximums der Schalldruckverteilung im Fokus (mit 515 kHz bei 188 mm3 und 1,46 MHz bei 10 mm3). Mit dem Ziel, in nachfolgenden Experimenten fokale BHS-Störungen nachzuweisen, wurde ausschließlich der höherfrequente 1,46-MHz-Wandler verwendet. Wie in den unten beschriebenen Experimenten zuverlässig gezeigt wurde, ermöglichte die Methode der Zentrierung des Fokus des 1,46-MHz-Wandlers an der Spitze der Kortikalis Störungen in der Größenordnung von 1 mm radial und 2,5 mm axial. Tatsächlich schwankte die Störungsgröße geringfügig als Funktion des Schalldrucks, der Mikrobläschendosis, der Burst-Dauer und der Anzahl der Bursts, aber bei den unten gezeigten „sicheren“ Parametern ermöglichte der 1,46-MHz-Wandler kortikale Störungen innerhalb der Grenzen der meisten kortikalen Zytoarchitektur Regionen von Interesse (z. B. in die medial-laterale Ausdehnung des Bereichs MIP passen).

Die Weißbüschelaffen SG, NE und T erhielten jeweils fünf oder acht kortikale Ultraschallbehandlungen (Bereich 8a, 4ab, MIP und V2) mit einem 1,46-MHz-Wandler. Abbildung 2 zeigt die Beschallungsorte und die damit verbundenen akustischen Drücke. Basierend auf den ersten Experimenten mit Weißbüschelaffen SG, die zeigten, dass reduzierte Schalldrücke von 0,95–1,70 MPa (und eine hohe Mikrobläschendosis von 400 μl/kg) eine zuverlässige Zerstörung der BHS ermöglichten, wurden Weißbüschelaffen NE und T mit niedrigeren reduzierten Drücken von 0,32–1,17 MPa beschallt und eine niedrigere Mikrobläschendosis von 200 μl/kg, um den Mindestdruck zu bestimmen, bei dem eine Störung der BHS eine Extravasation von GBCA und Evans-Blau-Färbung ermöglicht. Wie in Abb. 2 gezeigt, störten 0,53 MPa (reduziert) die BHS bei Weißbüschelaffen NE, nicht jedoch bei Weißbüschelaffen T. 0,74 MPa (reduziert) störten erfolgreich die BHS sowohl bei Weißbüschelaffen NE als auch T, es gab jedoch eine klare oberflächliche kortikale Tendenz Verteilung der BHS-Störung näher am Zentrum des Fokus des akustischen Strahls. Bei einem herabgesetzten Druck von 0,95 MPa zeigte Weißbüschelaffe NE eine deutliche Störung bei einer Größe, die ungefähr dem Volumen der vollen Breite bei halbem Maximum der Schalldruckverteilung im Fokus (2,5 mm axial mal 1 mm radial) entsprach, bei Weißbüschelaffen T jedoch weniger stark . Bei 1,17 MPa (reduziert) zeigten Weißbüschelaffen SG, NE und T eine konsistente Störung (beachten Sie, dass die GBCA-Wirkstoffdosis für Weißbüschelaffen SG mit 0,1 ml/kg niedriger war, aber siehe Foto der Evans-Blau-Färbung in Abb. 2 bei 1,17 MPa ).

a Resultierende Störung der Blut-Hirn-Schranke bei acht Ultraschallbehandlungen über die Kortikalis von Weißbüschelaffen SG, gezeigt durch Extravasation von Evans-Blau in Weißbüschelaffen SG. b Extravasation von GBCA mittels In-vivo-MRT bei Weißbüschelaffen SG. c, d Dasselbe wie (a, b) bei Marmoset NE, der bei niedrigeren Schalldrücken beschallt wurde. e, f Wie (c, d) in Marmoset T.

Die rechte Hemisphäre der Weißbüschelaffen NE und T wurde zur Bestimmung des minimalen Schalldrucks verwendet (Abb. 2), während die linke Hemisphäre zur Demonstration der minimalen Mikrobläschendosis verwendet wurde, die zur Störung der BHS erforderlich ist (Abb. 3). Jedes Tier wurde viermal beschallt (Bereich 8a, 4ab, MIP und V2), wobei die niedrigste Mikrobläschendosis für die hintersten Stellen von 0 μl/kg (V2) verwendet und dann auf 20 μl/kg (MIP) erhöht wurde, 100 μl/kg (4ab) und 200 μl/kg (8a) an den vorderen Stellen. Obwohl die Parameter (und der Zeitpunkt) ansonsten für Weißbüschelaffen NE und T gleich waren, störten 20 μl/kg die BHS bei Weißbüschelaffen NE, jedoch nicht vollständig bei Weißbüschelaffen T. Insgesamt störten 100 μl/kg erfolgreich die BHS bei beiden Tieren. ebenso wie 200 μl/kg. So zeigen wir mit unserem Gerät, dass die minimale Mikrobläschendosis für Einzelbolus-Injektionen in die Schwanzvene bei Krallenaffen im Bereich von 20–100 μl/kg bei 1,46 MHz liegt.

a Resultierende Störung der BHS bei vier Ultraschallbehandlungen mit unterschiedlichen Mikrobläschendosierungen in Marmoset NE. b Extravasation von GBCA mittels In-vivo-MRT bei Marmoset NE. c, d Gleich wie (a, b) in Marmoset T.

Mit insgesamt 12 Ultraschallbehandlungen (von denen 8 in den beiden vorherigen Abschnitten beschrieben werden) erhielt Marmoset T auch vier Ultraschallbehandlungen (parietale Bereiche PFG rechts, PE rechts, PE links und PFG links), um die Fähigkeit zu bestimmen, die BHS quer zu stören mehrere Stellen nach einer einzigen Bolusinjektion von Mikrobläschen. Abbildung 4 zeigt die Beschallungsorte 30, 120, 240 und 480 s nach einer einzelnen Bolusinjektion von 200 μl/kg Mikrobläschen; Jede der vier Ultraschallbehandlungen hatte die folgenden Parameter: verringerter Schalldruck = 1,17 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 60. Bei 1,17 MPa zeigte nur die Ultraschallbehandlung 30 s nach der Mikrobläscheninjektion eine Störung ermöglichte eine deutliche Extravasation von GBCA und Evans-Blaufärbung bei dem ungefähren Volumen bei FWHM der Schalldruckverteilung im Fokus, wie durch die Ellipsoide in Abb. 4a – e dargestellt. Marmoset M hatte die gleichen Beschallungsparameter und wurde verwendet, um die Fähigkeit zu bestimmen, die Blut-Hirn-Schranke 30, 60, 90 und 120 s (zwischen den ersten beiden Punkten von Marmoset T) nach einer einzelnen Bolusinjektion zu zerstören. Aus diesen Daten geht hervor, dass die effektive Clearance-Zeit einer 200 μl/kg-Dosis kommerziell erhältlicher Mikrobläschen (Definity) im Gehirn von Weißbüschelaffen weniger als 2 Minuten beträgt des physiologischen Zustands des Tieres (z. B. Herzfrequenz, Nierenfunktion). Allerdings war die Dosis hier mit 200 μl/kg relativ hoch, so dass die Verfügbarkeit von Blasen im Kreislauf nicht viel höher sein könnte, ohne dass es zu Schäden kommt. Bei den hier vorgestellten (anderen) Experimenten haben wir vor jeder Ultraschallbehandlung injiziert, anstatt einen einzelnen Bolus oder eine einzelne Infusion für mehrere Ultraschallbehandlungen zu verwenden, wobei zwischen den Injektionen mindestens 5 Minuten lagen. Wahrscheinlich aufgrund von Gewebeschwankungen (z. B. Muskeln, Fett) zwischen der beschallten Stelle und dem Hydrophon stellten wir fest, dass das Fourier-Spektrum der überwachten Kavitationsemissionen kein besonders zuverlässiger Index für BHS-Störungen ist (mit der Grundwahrheit des Evans-Blaus). Färbemikroskopie). Dieses Experiment bot jedoch die Möglichkeit, Spektren erfolgreicher und erfolgloser Aufschlüsse mit identischen Parametern zu vergleichen, wobei nur die verfügbaren Mikrobläschen im Umlauf variierten. Bei diesen vier Beschallungen (Marmoset T) traten Breitbandrauschen und ein Anstieg der subharmonischen Amplitude um etwa die Hälfte der Wandlerfrequenz (0,73 MHz) im Zusammenhang mit Kavitation auf, die einer Störung 30 und 120 s nach der Mikrobläscheninjektion entsprach, jedoch nur 30 s nach der Injektion -Mikrobläschen-Injektionsbeschallung zeigte eine erfolgreiche Öffnung der Blut-Hirn-Schranke (ergänzende Abbildung 2).

a Beschallungszielorte für Marmoset T 30–480 s nach einer einzelnen Bolusinjektion von 200 µl/kg Mikrobläschen. b GBCA-Kontrastverstärkung aufgrund erfolgreicher BHS-Störung bei Marmoset T. c Stellen in Marmoset T, wie durch Evans-Blau-Färbung angezeigt. d Beschallungszielorte für Marmoset M, jedoch 30–120 s nach einer einzelnen Bolusinjektion von Mikrobläschen mit 200 µl/kg. e Dasselbe wie (b) für Weißbüschelaffen M. Hinweis: Die MRT-Sequenz variierte für Weißbüschelaffen T und M aufgrund der Teilnahme von Weißbüschelaffen M an anderen Experimenten, aber beide zeigten deutlich einen T1-gewichteten GBCA-Kontrast. Bei Marmoset M wurde kein Evans-Blau injiziert.

Da die Auswirkungen der akustischen Reflexion durch den Winkel und die Dicke des Schädels27 bekannt sind, versuchten wir, diese Effekte durch Beschallung mit 1,46 MHz über verschiedene Schädelwinkel des Weißbüschelaffenkopfes direkt zu testen. Wie in der Darstellung des Geräts in Abb. 1 gezeigt, war unser Wandler immer parallel zur stereotaktischen Ebene (dh der Z-Ebene, die der Mitte der Ohrbügel und der Unterseite der Augenbügel entspricht) und war somit in Bezug auf die Variation fixiert Schädelwinkel. Zusätzlich zur in vivo GBCA-verstärkten MRT wurden hochauflösende (50 μm isotrope) CT-Bilder in Weißbüschelaffen SP aufgenommen, um den Schädel zu isolieren und Winkel tangential zur Schädeloberfläche (tangential zum Punkt am Schnittpunkt des axialen Zentrums) genau zu messen des Beschallungsellipsoids) (Abb. 5). Bei hohem (reduziertem) Druck (1,70 MPa, 400 μl/kg Mikrobläschendosis) entsprach die Größe der BHS-Störung der FWHM der erwarteten Beschallungsverteilung, was darauf hindeutet, dass die Beschallungen, die planar zum (über dem) Weißbüschelaffenschädel liegen, durch den Schädel nicht beeinträchtigt wurden Winkel. Dementsprechend scheint der dünne Schädel von Weißbüschelaffen (~ 1 mm oder weniger) im Vergleich zu anderen Arten für fokussierten Ultraschall geeignet zu sein, wobei hier eine Reduzierung von 47 % direkt durch die Schädel von Weißbüschelaffen gemessen wurde. Es ist auch erwähnenswert, dass der Schalldruck und die Mikroblasendosis für dieses Experiment zwar hoch waren, die Daten aus Abb. 2, 3, 6 oder 7 zeigen auch, dass der Schädelwinkel bei niedrigeren Schalldrücken und Mikrobläschendosierungen einen minimalen Effekt zu haben scheint. Aufgrund der Fokussierung unseres Schallkopfes (Brennweite = 24,5 mm) müssen wir diese Effekte noch tiefer im Gehirn etablieren. Mit dem hier verwendeten Wandler konnten wir den Schallstrahl nur 11 mm von der Oberseite des Weißbüschelaffenkopfes effektiv zentrieren, wodurch die Möglichkeit zur Feststellung solcher Effekte eingeschränkt war.

a Dreidimensionale Darstellung des CT von Marmoset SP, wobei die schwarzen gestrichelten Linien das Fenster für das in (b) gezeigte MIP-Bild (Maximum Intensity Projection) zeigen. b Verteilung der Dichte (indiziert durch Hounsfield-Einheiten (HU)) über den Schädel von Marmoset SP in Bezug auf die Beschallungsorte 1 und 2 – abgesehen von der Stelle weisen die Beschallungsorte 1 und 2 dieselben Parameter und Mikrobläschendosis auf. c Koronaler Schnitt des Schädels von Marmoset SP mit überlagertem Beschallungsort (FWHM der Schalldruckverteilung im Fokus) und dem Schädelwinkel (gestrichelte grüne Linie tangential zum Schädel). Beachten Sie, dass die Öffnung aufgrund der hohen GBCA-Dosierung, die bei diesem Tier verwendet wurde, eher hypo- als hyperintensiv erscheint. d Resultierende Öffnung mit In-vivo-GBCA-MRT, ausgerichtet auf die CT desselben Tieres. e Trotz der unterschiedlichen Dicke und des Schädelwinkels wurde die Größe der BHS-Öffnung nur minimal beeinflusst, wobei die Evans-Blau-Färbung (Mikroskopiebild ausgerichtet auf CT) zeigte, dass das Öffnungsvolumen der Beschallungsstelle 2 95 % des Öffnungsvolumens der Beschallungsstelle 1 betrug. f, g Gleiche Bilder wie in (d), aber in sagittalen Schnitten mit grüner gestrichelter Linie, die den Schädelwinkel an dieser Stelle zeigt.

eine Extravasation von Evans Blue, die die resultierende Störung der BHS an der Stelle von acht Beschallungen mit unterschiedlichem Arbeitszyklus und unterschiedlicher Anzahl von Ausbrüchen in Marmoset SK bei 1,7 MPa zeigt. b Extravasation von GBCA mittels In-vivo-MRT bei Marmoset SK. c Wie (a), für Marmoset M bei einem niedrigeren Schalldruck von 1,17 MPa. d Wie (b) für Marmoset M. Beachten Sie, dass die MRT-Sequenz für Marmoset SK und M aufgrund der Teilnahme von Marmoset M an anderen Experimenten variierte, aber beide zeigten deutlich einen T1-gewichteten GBCA-Kontrast.

ein Ziel für eine einzelne Beschallung in Marmoset G, Bereich 8a. b Austreten von Evans-Blau als Ergebnis der Ultraschallbehandlung in (a). c Immunfärbung am beschallten Schnitt, wobei C1 die linke (nicht beschallte) Hemisphäre und C2 die rechte Hemisphäre innerhalb der Grenzen des beschallten Bereichs zeigt. Im Vergleich zur linken Hemisphäre war in der rechten Hemisphäre ein deutlicher Anstieg der Iba1+-Zellen deutlich erkennbar. Iba1+-Zellen weisen in der rechten Hemisphäre größere Zellkörper und dicke Fortsätze auf, wohingegen Iba1+-Zellen in der linken Hemisphäre viel zahlreichere und feinere Fortsätze aufweisen. d In-vivo-GBCA-MRT mit GBCA-Boli, die 2, 5 und 8 Stunden nach der Ultraschallbehandlung injiziert werden. Wie sich in den Stunden nach den Bolusinjektionen (Stunden 3 und 4, auch Stunden 6 und 7) zeigte, blieb die Größe des GBCA gleich (d. h. minimale Diffusion), nahm jedoch mit den nachfolgenden Bolusinjektionen in den Stunden 5 und 8 zu, was darauf hindeutet Die Blut-Hirn-Schranke war 8 Stunden nach der Ultraschallbehandlung immer noch geöffnet. e Durchblutetes Gehirn von Marmoset G, Beschallungsstelle mit einem roten Pfeil markiert, was darauf hindeutet, dass an dieser Stelle keine Anzeichen einer Blutung vorliegen. f Ziel für eine einzelne Beschallung in Marmoset M, Bereich 8a. g Extravasation von GBCA, injiziert als Bolus 2 Stunden nach der Ultraschallbehandlung, dann erneut eine zweite Bolusinjektion nach 2 Wochen. Nach 2 Wochen war die BHS für den GBCA nicht mehr durchlässig.

Marmosets SK erhielt 8 Ultraschallbehandlungen und Marmoset M 6 Ultraschallbehandlungen, um die Auswirkung der Burst-Dauer und der Anzahl der Bursts auf das Ausmaß der BHS-Störung zu bestimmen – und, wenn auch unbeabsichtigt, das Ausmaß und die Art des Schadens bei hohem Schalldruck bei Marmoset SK (Abb. 6). ). Bei Weißbüschelaffen SK führten tatsächlich alle getesteten Arbeitszyklen (5, 10, 20 und 30 ms) und die Anzahl der Stöße (5, 10, 20, 40) zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke bei Weißbüschelaffen SK . Diese Daten sind jedoch besonders nützlich, um das Ausmaß der Schäden aufzuzeigen, die bei extremen Schalldrücken, Burst-Dauern und hohen Mikrobläschendosierungen (400 μl/kg) auftreten können, wie in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Für Marmoset M Allerdings lagen der herabgesetzte Druck (1,17 MPa) und die Mikroblasendosis (200 μl/kg) näher an der Grenze sicherer Beschallungsparameter. Bei den getesteten Parametern, die nur 5 Bursts (20 ms Burst-Dauer) oder 5 ms Burst-Dauer (60 Bursts) betrugen, stellten wir fest, dass wir wahrscheinlich über dem Minimum lagen, um die BHS zu stören. Diese Daten deuten darauf hin, dass die Störung wahrscheinlich bei den ersten Ausbrüchen auftritt, wenn die Konzentration der zirkulierenden Mikrobläschen am höchsten ist. Dies ist ein besonders gutes Zeichen für Anwendungen, bei denen sehr schnelle Ultraschallbehandlungen von Vorteil sind, beispielsweise wenn das Tier wach ist und eine Aufgabe ausführt.

Marmoset G erhielt eine einzelne Beschallung (Bereich 8a, rechte Hemisphäre) mit einem 1,46-MHz-Wandler und den folgenden Parametern: reduzierter Schalldruck = 0,95 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 60, Mikrobläschendosis = 100 μl/kg. Wie in Abb. 7 gezeigt, wurde eine BHS-Störung durch In-vivo-GBCA-verstärkte MRT und Evans-Blau-Färbung berichtet. Aus den vorherigen Experimenten und den in den Abbildungen gezeigten Ergebnissen. 7–9 haben wir festgestellt, dass diese Parameter sowohl sicher als auch effektiv beim Öffnen der BHS sind. Neben dem Nachweis der Sicherheit und Zuverlässigkeit des Öffnens mit den oben genannten Parametern wollten wir auch ermitteln, wie lange die BBB geöffnet blieb. Da es sich um ein geplantes Endexperiment handelte (mit bereits injiziertem Evans-Blau, was eine Genesung des Tieres ausschloss), konnten wir die Obergrenze der Dauer der BHS-Störung nicht bestimmen. Unser letzter Bildgebungspunkt war vielmehr 8 Stunden nach der Injektion. Wie in Abb. 7 dargestellt, war die Blut-Hirn-Schranke 8 Stunden nach der Beschallung eindeutig noch offen, was durch die erhöhte Intensität und Verteilung infolge der GBCA und zu Beginn des Scans 8 Stunden nach der Beschallung angezeigt wurde. Marmoset M wurde jedoch kein Evans-Blau injiziert, sondern zwei Wochen nach der Ultraschallbehandlung wurde GBCA injiziert – die Blut-Hirn-Schranke erlaubte nicht mehr den Durchtritt einer ausreichenden GBCA-Menge, um nachgewiesen zu werden. Beachten Sie, dass die Bilder aus Abb. 6 zur gleichen Zeit wie das Bild von Marmoset M in Abb. 7 aufgenommen wurden (was zeigt, dass die GBCA-Injektion erfolgreich war), wobei an den Stellen, die zwei Wochen nach der ersten 8a-Beschallung beschallt wurden, GBCA austrat.

a Evans-Blau-Mikroskopiebild der Beschallung bei 0,95 MPa mit einer Mikrobläschendosis von 100 µl/kg in Weißbüschelaffe G. b H&E-gefärbter Schnitt von Interesse aus (a). Schwarze Kästchen, die die H&E-Bilder überlagern, zeigen die Position des vergrößerten Bildes unten. c GBCA-Bild der Beschallung bei 0,95 MPa mit 0,95 MPa und einer Mikrobläschendosis von 200 µl/kg in Marmoset T. d H&E für (c). e Wie (a), unter Verwendung von 1,17 MPa mit einer Mikrobläschendosis von 200 µl/kg in Marmoset NE. f H&E für (e). g Wie (a), Marmoset T: 1,17 MPa, 200 µl/kg Mikrobläschen-Dosis. h H&E für (g). i Wie (a), Marmoset SK: 1,7 MPa, 400 µl/kg Mikrobläschendosis. j H&E für (h). k Wie (a), Marmoset E: 1,7 MPa, 400 µl/kg Mikrobläschen-Dosis. l H&E für (k).

a GBCA-Menge, die als Funktion des verringerten Schalldrucks in das Hirnparenchym extravasiert wird. Verschiedene Weißbüschelaffen werden durch die Punktfarbe gekennzeichnet. Die gestrichelte Linie zeigt die Anpassung der linearen Regression unter Berücksichtigung der Varianz aufgrund des herabgesetzten Drucks. b Erfolgreiche BBB-Extravasation von GBCA als Funktion der Mikrobläschendosis, unabhängig von anderen Parametern.

Um zu bestimmen, welche Parameter die größte Varianz bei der erfolgreichen Extravasation von GBCA über die BHS ausmachten, wurde eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt. Die Daten sind in Abb. 9a dargestellt. Quelldaten gefunden in Supplementary Data 1. Die Ergebnisse der Regression zeigten, dass zwei Prädiktoren 38,2 % der Varianz erklärten (R2 = 0,38, F(42) = 5,2, p < 0,00). Der verringerte Schalldruck sagte das extravasierte Volumen signifikant voraus (β = 0,83, p < 0,02), während die Mikrobläschendosis, die Anzahl der Ausbrüche, die Ausstoßperioden und das Tiergewicht das Volumen nicht signifikant vorhersagten. Als das gleiche Modell mit schrittweiser Regression berechnet wurde, sagte der herabgesetzte Druck allein 31,1 % der Varianz voraus (R2 = 0,31, F(46) = 20,7, β = 1,13, p < 0,00). Die Mikrobläschendosis hing jedoch signifikant davon ab, ob eine BHS-Öffnung erreicht wurde, wie durch eine lineare Regression mit einer binärisierten abhängigen Variablen (BBB-Störung oder nicht) quantifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass zwei Prädiktoren 31,3 % der Varianz erklärten (R2 = 0,31, F(42) = 3,7): Mikrobläschendosis (β = 0,00, p = 0,01) und Tiergewicht (β = 4,62, p = 0,02). Darüber hinaus wurde unabhängig von anderen Parametern eine Störung der Blut-Hirn-Schranke bei 50 % der Ultraschallbehandlungen mit einer Dosierung von 20 µl, 80 % der Ultraschallbehandlungen mit 100 µl, 89 % mit 200 µl und 100 % mit 400 µl erreicht (siehe Abb. 9b).

Um die Effizienz und Sicherheit der BHS-Störung entsprechend Änderungen des Schalldrucks und der Mikrobläschendosis zu bestimmen, wurden sowohl die Evans-Blau-Extravasation als auch die histologische Gewebeschädigung als Reaktion auf einen herabgesetzten Schalldruck von 0,95, 1,17 und 1,70 MPa mit 100, 200 oder 400 bestätigt μl/kg Mikrobläschen-Dosierung. Wie in Abb. 8 dargestellt, wurde eine Evans-Blau-Extravasation bei einem verringerten Schalldruck von 0,95 MPa und einem höheren Schalldruck (1,17 und 1,70 MPa) beobachtet. Ein Schalldruck von 1,70 MPa bei einer Mikrobläschen-Dosierung von 400 μl/kg verursachte bei Weißbüschelaffen SK schwere Gewebeschäden und große Ansammlungen von Erythrozytenextravasationen, wohingegen ein Schalldruck von 1,17 MPa bei Weißbüschelaffen G und T zu einer Zerstörung der BHS führte, ohne dass offensichtliche Gewebeschäden oder Mikroblutungen auftraten Darüber hinaus konnte bei der Untersuchung der NeuN-Immunfärbung in dieser Region kein offensichtlicher neuronaler Schaden festgestellt werden (Abb. 7). Die Expression des ionisierten Calcium-bindenden Adaptermoleküls 1 (Iba1) wird bei der Mikroglia-Aktivierung hochreguliert. Daher verwendeten wir die Immunfärbung dieses Mikroglia-Markers als Maß für die Immunantwort. Im Vergleich zur kontralateralen Hemisphäre war in der ipsilateralen Hemisphäre ein deutlicher Anstieg der Iba1+-Mikroglia deutlich erkennbar (Abb. 7). Iba1+-Zellen zeigten größere Zellkörper und dicke Fortsätze in der ipsilateralen Hemisphäre, wohingegen Iba1+-Zellen viel zahlreichere und feinere Fortsätze in der kontralateralen Hemisphäre aufwiesen.

Als weitere Sicherheitsbewertung wurde eine histologische Gewebeschädigung als Reaktion auf reduzierte Schalldrücke von 0,95 und 1,70 MPa mit einer Mikrobläschendosierung von 100 oder 400 μl/kg bestätigt (Abb. 10). Ein Schalldruck von 1,70 MPa mit einer Mikrobläschen-Dosierung von 400 μl/kg führte bei Marmoset SK zu schweren Gewebeschäden und TUNEL-positiven Zellen, wohingegen ein Schalldruck von 0,95 MPa bei Marmoset G die Zerstörung der BHS erleichterte, wenn keine offensichtlichen Gewebeschäden oder TUNEL-positiven Zellen auftraten. Darüber hinaus führten wir bei Marmoset G eine zusätzliche Immunfluoreszenzfärbung mit zwei verschiedenen Antikörpern (CD68 und CD206) durch. Mikroglia und grenzassoziierte Makrophagen konnten nicht eindeutig unterschieden werden, da sie gemeinsame Mikroglia-/Makrophagen-Marker aufweisen. Wir konnten das Vorhandensein vermutlich aktivierter Iba1+-Mikroglia mit kürzeren und dickeren Fortsätzen im Vergleich zu den normalen überwachenden und stärker verzweigten Mikroglia in der kontralateralen Hemisphäre identifizieren. CD68 ist ein häufiger Marker für die Makrophagen-Abstammungslinie, der hauptsächlich in Mikroglia im Gehirnparenchym und in perivaskulären Makrophagen in den Blutgefäßen des Gehirns und gelegentlich im Parenchym lokalisiert ist. Obwohl es eine gewisse CD68-Expression auf ruhenden Mikroglia gibt, markiert es das Lysosom und wird daher allgemein als Marker für aktivierte phagozytische Mikroglia angesehen. CD206 ist ein Zelloberflächenprotein, das in ausgewählten Makrophagenpopulationen reichlich vorhanden ist. Es wurde keine nennenswerte Veränderung in der Anzahl der CD68+- oder CD206+-Zellen im Kortex von Marmoset G beobachtet (Abb. 10). Es gab nur wenige CD68+- und CD206+-Makrophagen, die im perivaskulären Raum und in den subduralen Meningen lokalisiert waren. Daher waren residente Mikroglia der wichtigste immunbezogene Zelltyp, der in der ipsilateralen Hemisphäre beobachtet wurde.

a TUNEL-positive Zellen im Gehirngewebe (Pfeile) in Marmoset SK. b TUNEL-positive Zellen in Marmoset G. c Die CD68-Expression in Marmoset G war im perivaskulären Raum lokalisiert. d Koronale Hirnschnitte mit Darstellung subduraler meningealer Endothelzellen (Tomatenlektin, rot) und Makrophagen (CD206, grün).

In dieser Studie versuchten wir, die Parameter zur fokalen Störung der BHS in einer Kohorte von Weißbüschelaffen zu ermitteln. Durch die Integration unserer MRT-basierten Weißbüschelaffenatlanten25,26 mit einem motorisierten stereotaktischen Positionierungssystem (RK-50 Marmoset; FUS Instruments Incorporated, Toronto, Ontario, Kanada, Abb. 1) konnten wir Stellen auf der Rückenoberfläche des Weißbüschelaffens gezielt beschallen Kortex mit hoher Genauigkeit (Abb. 1–8 und ergänzende Abb. 1) mittels sphärisch fokussierter Einzelelementwandler. Von den beiden getesteten Schallköpfen – bei 515 kHz und 1,46 MHz – stellten wir fest, dass der höherfrequente 1,46-MHz-Schallkopf (mit einer Brennweite von 24,5 mm) Störungen zuließ, die auf die etwa 2,5–3 mm kortikale Dicke der Krallenaffenrinde beschränkt werden konnten . Wir optimierten die Parameter (minimaler Schalldruck, minimale Mikrobläschendosis, Burst-Dauer, Anzahl der Bursts), ab denen eine BHS-Störung ohne Blutung oder Ödem auftrat und in dem Ausmaß, in dem es zu Evans-Blue- und/oder GBCA-Extravasation kam. Aus diesen Experimenten ermitteln wir Parameter für eine sichere BHS-Störung (wie durch H&E-Färbung und Immunhistochemie berichtet) beim Weißbüschelaffen bei 1,46 MHz. Bei diesen Parametern stellten wir fest, dass die räumliche Bindung der Evans-Blau-Färbung und die GBCA-Berichterstattung (Abb. 7) ähnlich waren, sodass die Bestimmung einer BHS-Störung in vivo mit MRT-basierten Kontrastmitteln durchgeführt werden kann. Zusammengenommen liefern die hier beschriebenen Experimente einen Bericht, auf dessen Grundlage minimalinvasive In-vivo-Experimente zur Substanzabgabe konzipiert werden können.

Wie das Gehirn von Nagetieren verfügen Weißbüschelaffen über einen lissenzephalen Kortex, was diese Art zu einem idealen Kandidaten für eine tFUS-basierte Störung der Blut-Hirn-Schranke macht und eine Beschallung entlang der säulenförmigen Organisation des Kortex ermöglicht, ohne durch kortikale Falten beeinträchtigt zu werden, die bei den meisten anderen Primatenarten vorhanden sind. Wie wir hier zeigen, können Beschallungsparameter von Nagetierarten (z. B. Ratten, Mäuse)8 jedoch nicht einfach auf die Verwendung bei Weißbüschelaffen übertragen werden, noch können sie auf andere größere nichtmenschliche Primatenarten wie Makaken (mit einem viel dickeren Schädel) angewendet werden und gefalteter Kortex)4. Zusätzlich zu den Parametern, die den Wandler antreiben, erschweren auch die physikalischen Eigenschaften der Wandler Vergleiche (z. B. Brennweite, Frequenz). Die hier vorgestellten Experimente zeigen, dass ein 35-mm-Einzelelement-Schallkopf mit sphärischem Fokus und 1,46 MHz für kortikale Störungen beim Weißbüschelaffen mit minimalen schädlichen Auswirkungen auf die Kopfmorphologie des Weißbüschelaffens (z. B. Schädeldicke oder das Vorhandensein von Schläfenmuskeln) verwendet werden kann; Abb. 5). Dies gilt insbesondere dann, wenn der Schwerpunkt auf oder nahe der Oberfläche der Kortikalis liegt (Abb. 1–8), was eine weitere räumliche Minimierung kortikaler Störungen ermöglicht. Die Verwendung eines Einzelelementwandlers anstelle einer Anordnung von Wandlern vereinfacht die zur Durchführung von tFUS beim Weißbüschelaffen erforderlichen Mittel. Wir nutzten ein motorisiertes Positionierungssystem und eine automatisierte Atlas-Zielerfassung, aber diese Experimente könnten auch mit einem an einem stereotaktischen Manipulatorarm montierten Wandler durchgeführt werden, wodurch die Ausrüstung, die für die Beschallung des Weißbüschelaffengehirns mit fokussiertem Ultraschall erforderlich ist, weiter vereinfacht wird.

Obwohl zu beachten ist, dass Mikrobläschen-Experimente (Dosierung, Clearance-Zeit) Parameter- und Transducer-abhängig sein können28, haben wir herausgefunden, dass die minimale Mikrobläschen-Dosierung (Definity, Lantheus Medical Imaging, Billerica, MA, USA) über den Schwanz- oder Saphenus- Die intravenöse Injektion betrug mehr als 20 μl/kg, wenn sie als Bolus injiziert wurde (Abb. 3 und 9b für % erfolgreicher BHS-Extravasationen als Funktion der Dosis). Um eine kleinere Verteilung der Mikrobläschen anzustreben (wobei größere Bläschen mehr Auftrieb haben), haben wir mit einer 21-Gauge-Nadel so nah wie möglich am Boden des Mikrobläschenfläschchens gezogen (nach Aktivierung und langsamem Umdrehen des Fläschchens) und eine weitere 21-Gauge-Nadel verwendet. Messnadel, um die Durchstechflasche zu entlüften. Wir haben uns außerdem für die Verwendung eines 26-Gauge-Katheters entschieden, um eine vorzeitige Zerstörung der Mikrobläschen während der Injektion unserer mit Kochsalzlösung verdünnten Mikrobläschenlösung zu vermeiden. Bei ersten Experimenten stellten wir fest, dass die Verwendung einer federbelasteten Verlängerung zu einer inkonsistenten BHS-Störung führte, was wahrscheinlich auf ein vorzeitiges Platzen der Mikrobläschen zurückzuführen war. Daher erfolgten alle Injektionen direkt in den Katheteransatz. Was die Mikrobläschen-Clearance-Zeit angeht, stellten wir fest, dass sie beim Weißbüschelaffen selbst bei einer hohen Dosis von 200–400 μl/kg relativ schnell (<2 Minuten) abläuft – zumindest soweit, dass die zirkulierende Mikrobläschenkonzentration zu einer Störung der Blut-Hirn-Schranke führte (Abb. 4). Wir fanden heraus, dass die akustischen Emissionen nach 30 s auf eine Kavitation der Mikroblasen hindeuteten, was durch ein erhöhtes Breitbandsignal um die Subharmonische herum angezeigt wurde. Insbesondere im Einklang mit früheren Berichten bei Ratten8, die einen ähnlichen Wandler und eine ähnliche Hydrophon-Hardware verwendeten, war subharmonisches Breitbandrauschen 30 und 120 s nach der Bolusinjektion der Mikrobläschen erkennbar (ergänzende Abbildung 2); Es ist erwähnenswert, dass unser Hydrophon eher für subharmonische Kavitation als für ultraharmonische Signale sensibilisiert war, wobei die Empfindlichkeit bei ~73 kHz um Größenordnungen höher war als bei den harmonischen und ultraharmonischen Frequenzen. Dies entsprach wahrscheinlich einer Mikrobläschenkavitation, obwohl es nicht einer Öffnung 120 s nach der Mikrobläscheninjektion entsprach. Dieser subharmonische Effekt war 240 oder 480 Sekunden nach der Mikrobläscheninjektion nicht erkennbar.

Unsere ursprüngliche Absicht, die BHS-Störung als Funktion der Burstdauer und der Anzahl der Bursts zu bestimmen, bestand nicht darin, den Schaden (mit bloßem Auge sichtbar, Abb. 6) zu beurteilen, sondern, wie durch die H&E-Färbung (ergänzende Abb. 3) gezeigt, den Druck Die für Weißbüschelaffen SK verwendete Menge lag über dem als sicher geltenden Maß (Abb. 8). Diese Daten sind jedoch besonders nützlich, um das Ausmaß der Schäden aufzuzeigen, die bei extremen Schalldrücken, Burst-Dauern und hohen Mikrobläschendosierungen (400 μl/kg) auftreten können. Wir fanden heraus, dass diese Ultraschallbehandlungen zu diffusen Gewebeschäden führten, die normalerweise mit Mikroblutungen einhergingen. Von besonderem Interesse stellten wir fest, dass der Subduralraum eine Blutung aufwies. Dieser Bereich ist aufgrund der zahlreichen perforierenden Arterien auf engstem Raum besonders empfindlich für Blutungen, weshalb die Mikrobläschenkonzentration möglicherweise höher war. Im Vergleich zu anderen Arten stehen die herabgesetzten Drücke (Abb. 9) im Einklang mit einer sicheren Öffnung der Blut-Hirn-Schranke und auch einem Druck, der kortikale Gewebeschäden verursacht, wobei die mechanischen Indizes hier zwischen ~0,26 und 1,4029,30,31,32,33,34 liegen. 35,36,37. Es ist wichtig zu beachten, dass wir zwar mehrere Stellen beschallen, um die Öffnungsparameter zu testen, es jedoch bei der Beschallung benachbarter Stellen zu einer erneuten Störung im Zusammenhang mit einer sterilen Entzündung kommen kann38,39. Hier haben wir ein Gitter mit einem Mindestabstand von 8 mm beschallt, mit Ausnahme der Krallenaffen T und G, bei denen weitere 4 Beschallungen entlang der parietalen Kortikalis erfolgten (obwohl diese Beschallungen, wie in Abb. 4 dargestellt, nicht zu einer Öffnung der BHS führten). . Daher sollten die hier vorgestellten Parameter für einzelne Beschallungen (oder mehrere Beschallungen mit geringem Abstand) berücksichtigt werden, nicht für wiederholte proximale Beschallungen, wie in Lit. gezeigt. 38.

Angesichts der Ergebnisse der H&E-Färbung der Tiere, die zuverlässig erfolgreiche Störungen der BHS zeigten (Abb. 2–6), verwendeten wir die unserer Meinung nach sicheren Parameter (reduzierter Schalldruck = 0,95 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst). Periode = 1000 ms, Anzahl der Ausbrüche = 60, Mikrobläschendosis = 100 μl/kg) an eine frontale Stelle (Bereich 8a) in Krallenaffen G, um die Zeitdauer zu bestimmen, während der die BHS offen blieb, gemessen an der Durchlässigkeit für einen Bolus von GBCA 2, 4 und 8 Stunden nach der Ultraschallbehandlung. Die Blut-Hirn-Schranke war 8 Stunden nach der Beschallung deutlich geöffnet, was durch die erhöhte Intensität und Verteilung aufgrund der GBCA und zu Beginn des Scans 8 Stunden nach der Beschallung angezeigt wurde (Abb. 7). Obwohl diese lang anhaltende Störung ein gewisses Risiko (z. B. durch Blut übertragene Bakterien) bergen kann, das die BHS normalerweise vor zirkulierenden Toxinen oder Krankheitserregern im Blutkreislauf schützen würde40, ist es ein experimentell vorteilhaftes Behandlungsfenster für die Injektion von Substanzen, deren Injektion gefährlich sein kann ein Bolus statt einer langsamen Infusion. Die Histologie und Immunhistochemie bei Weißbüschelaffen G stützten die vorherigen Ergebnisse, dass die Parameter sicher waren, sodass bei der H&E-Färbung keine offensichtlichen Schäden beobachtet wurden (Abb. 8 und 10). Es gibt eine sichtbare Mikroglia-Aktivierung (Abb. 7) aufgrund einer Gewebestörung (Iba1), jedoch keine Gewebeschädigung (DAPI, NeuN, H&E) im Vergleich zu einer kontralateralen, nicht beschallten 8a-Stelle, was darauf hindeutet, dass dies sichere und zuverlässige Parameter zum Öffnen der BHS sind über einen längeren Zeitraum. Mikroglia in kortikalen Regionen zeigten Anzeichen einer Aktivierung durch erhöhte Iba1-Expression und Veränderungen in Zellkörpern und -prozessen, ohne signifikante Veränderungen in der Zellzahl. Es wurde gezeigt, dass eine FUS-induzierte BHS-Störung eine vorübergehende Glia-Aktivierung auslöst38. Je nach Art und Schwere der Hirnverletzung können aktivierte Mikroglia sowie infiltrierende Makrophagen Neuroinflammation und Neurodegeneration verschlimmern. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Mikroglia-Aktivierung 15 Tage nach FUS abgeklungen ist, ohne dass sich eine Glia-Narbe entwickelte, was darauf hindeutet, dass FUS keine läsionsähnliche Mikrogliose verursacht41.

Zusammenfassend demonstrieren wir eine sichere und wirksame Störung der BHS im Weißbüschelaffen mit einer räumlichen Spezifität von ~1 mm radial und 2,5 mm axial (im Kortex) unter Verwendung eines 1,46-MHz-Wandlers. Wir konnten die Blut-Hirn-Schranke auf der dorsalen Oberfläche des Weißbüschelaffen-Kortex zuverlässig stören, wobei der minimale Schalldruck zwischen 0,95 und 1,16 MPa und die minimale Mikroblasendosis von 20 μl/kg über die Schwanzveneninjektion reduziert wurde. Darüber hinaus stellten wir fest, dass der Schalldruck bei 1,46 MHz im gesamten Schädel des Weißbüschelaffen um 47 % verringert war. Wir zeigen, dass diese Parameter (gepaart mit 60 20-ms-Bursts im Abstand von 1000 ms) dazu führten, dass die BHS länger als 8 Stunden geöffnet war und nicht zu einer Schädigung des kortikalen Gewebes führte, wie durch H&E-Färbung berichtet. In Übereinstimmung mit früheren Berichten zu anderen Arten stellten wir fest, dass der Schalldruck die größte Varianz unter den getesteten Variablen ausmachte und in linearem Zusammenhang mit dem Extravasationsvolumen stand32,42,43. Höhere Schalldrücke und/oder eine übermäßige Mikrobläschendosis (>200 μl/kg) führten zu Gewebeschäden (Abb. 8). Die hier vorgestellte Versuchsreihe etabliert Methoden zur sicheren, reproduzierbaren und fokalen Störung der BHS mithilfe von tFUS beim Weißbüschelaffen.

Neun erwachsene Weißbüschelaffen (Callithrix jacchus) steuerten Daten zu dieser Studie bei (Ergänzungstabelle 1). Die Tiere wurden sowohl für die tFUS- als auch für die In-vivo-MRT-Verfahren mit 2 % Isofluran über eine Maske anästhesiert (induziert und aufrechterhalten). Während der Eingriffe wurden Herzfrequenz, Sauerstoffversorgung des Blutes, Atmung und Rektaltemperatur überwacht. Der Kopf wurde mit einer Haarschneidemaschine rasiert, anschließend wurden alle verbleibenden Haare mit Enthaarungscreme entfernt. Zur Abgabe von Mikrobläschen und Kontrastmittel wurde ein 26-Gauge-Katheter (1/2 oder 3/4 Zoll Länge) in den lateralen Schwanz oder die Vena saphena platziert. Die Körpertemperatur wurde mit Infrarot- oder beheizten Wasserdecken aufrechterhalten. Das experimentelle Verfahren entsprach den ethischen Richtlinien für Tierversuche, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der University of Pittsburgh genehmigt wurden.

Ultraschallbehandlungen wurden mit dem RK-50 Marmoset (FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Kanada) durchgeführt, das in Zusammenarbeit mit FUS Instruments für den Einsatz bei Weißbüschelaffen entwickelt wurde, um spezifische Hardware für Weißbüschelaffen zu implementieren, einschließlich eines stereotaktischen Geräts für Weißbüschelaffen (Modell SR-AC). ; Narishige International Incorporated, Amityville, New York, USA) und um einen MRT-basierten Krallenaffenatlas für stereotaktisches Targeting25,26 (Abb. 1) einzubeziehen. Das System verwendet ein automatisches 3-Achsen-Positionierungssystem, das unter Bezugnahme auf die stereotaktische Position auf der Behandlungsplanungs-Workstation konfiguriert wird, auf der die MORPHEUS-Software läuft (MORPHEUS-Framework, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Kanada). Das 3-Achsen-Positionierungssystem führte einen von zwei sphärisch fokussierten und kalibrierten 35-mm-Wandlern, die in dieser Studie verwendet wurden, entweder ein 515-kHz- oder ein 1,46-MHz-Wandler (FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Kanada), der starr am Positionierungssystem montiert war, um dies zu ermöglichen zur präzisen Kontrolle des Beschallungsortes. Die Beschallungsparameter – Amplitude, Anzahl der Impulse, Wiederholungsperiode und Anzahl der Bursts – wurden im MORPHEUS-Softwarepaket eingestellt. Für jeden Wandler wurden die Spannungs-Druck-Werte vom Hersteller kalibriert und wie im folgenden Abschnitt beschrieben, haben wir die Leistung des 1,46-MHz-Wandlers vor Ort validiert. Die Anzahl der Pluspunkte, die Wiederholungsperiode und die Anzahl der von der Software befohlenen Bursts wurden von einem externen Wellenformgenerator (Siglent SDG 1032X, Siglent Technologies, Solon, Ohio, USA) generiert und über einen 15-W-Verstärker an den Wandler gesendet. Zur Überwachung der Kavitationsemissionen des Hydrophons, das konzentrisch zu den Wandlern montiert war, wurde ein digitales Oszilloskop verwendet. Wie in Abb. 1a dargestellt, wurde der Wandler mit einer 3D-gedruckten Abdeckung mit einer O-Ring-Dichtung und einer Polyimidfilmoberfläche abgedichtet, die entgastes Wasser aufnahm (über einen tragbaren Wasserentgaser; FUS-DS-50, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON). , Kanada). Der Sensor und die Abdeckung wurden in einen Tank mit ca. 300 ml entgastem Wasser getaucht. Der Polyimidboden des Tanks wurde über Ultraschallgel mit dem Kopf verbunden.

Um die Leistung des FUS-Systems zu validieren und genau zu quantifizieren, welche Parameter Gewebeschäden oder Entzündungen entsprechen, haben wir die Tischleistung des 1,46-MHz-Wandlers mit einem Kapselhydrophon (HGL-0085, ONDA Corporation, Sunnyvale, CA, USA) und digital gemessen Oszilloskop (WaveRunner 6051A, Teledyne LeCroy, Chestnut Ridge, NY, USA). Pulsdauer (2 ms), Burst-Periode (500 ms) und Frequenz (1,46 MHz) sowie die Spitzenlinearität der negativen Spannung (zwischen 0,2 und 3,8 MPa) wurden über die MORPHEUS-Software gesteuert und durch Hydrophonmessungen in einem entgasten Wasserbad bestätigt wobei das Hydrophon mit einer starren Wandler-zu-Hydrophon-Halterung auf die Mitte des Fokus eingestellt wird.

Nachdem die zeitliche Genauigkeit bestätigt war, testeten wir dann die räumliche Genauigkeit des 1,46-MHz-Wandlers, der in derselben 3-Achsen-Positionierung montiert war, die wir für die Zielerfassung bei Weißbüschelaffen verwendet hatten. Zu diesem Zweck haben wir eine maßgeschneiderte Acrylplatte (Polymethylmethacrylat, Nr. 8589K922, McMaster-Carr Supply Company, Elmhurst, IL, USA) entworfen und gefräst (Roland Modela MDX-50), die an den Rändelschrauben der Ohrstange des Stereotax befestigt werden soll , dann in der gleichen relativen Position wie das Gehirn des Weißbüschelaffen zentriert (siehe ergänzende Abbildung 1a). Acryl wurde aufgrund seines relativ niedrigen Schmelzpunkts von 160 °C und seines relativ hohen Biegemoduls von 490 kip/si ausgewählt, so dass es präzise gefräst und mit minimaler Biegung im Stereotakt montiert werden konnte, während es gleichzeitig mit minimiertem Energieeintrag schmolz und so das Potenzial minimierte Beschädigung des Wandlerelements. Die Dauer einer kontinuierlichen Ultraschallbehandlung wurde verlängert, bis ein Schmelzen auftrat (10 s bei 2,2 MPa), dann wurden 24 Punkte in einem 20 × 20 mm großen Raster mit 5 mm Abstand zwischen den Punkten und dem durch definierten Mittelpunkt (entspricht 0 mm) beschallt ein gefräster Punkt, von dem aus die stereotaktischen Koordinaten ausgerichtet wurden (siehe ergänzende Abbildung 1b). Nach dem Schmelzen des Punktgitters wurde die Acrylplatte in ein 200-ml-Kaliumjodbad mit 5 mM (M5005; Sigma-Aldrich Co., MO) gegeben und mit einem Kleintier-CT (Si78; Bruker BioSpin GmbH, Ettlingen, Deutschland) gescannt ) unter Verwendung eines 1-mm-Aluminiumfilters mit niedriger Dosis, einer Auflösung von 200 × 200 × 200 μm (Sichtfeld = 79,6 × 81,1 mm) und einer „Step-and-Shoot“-Methode (0,6-Grad-Gantry-Schritt) und unter Verwendung des gefilterten Rückprojektionsalgorithmus rekonstruiert . Durch das Eintauchen der Platte in Jod konnten wir die Konturen des geschmolzenen Acryls im Vergleich zum Scannen im Freien besser erkennen (ergänzende Abbildung 1c – f). Um die geschmolzene Acrylplatte mit den Zielpositionen zu vergleichen, haben wir eine 3D-CAD-Datei mit den idealen Zielpositionen erstellt, diese Datei in das NIfTI-Format konvertiert und sie anhand des gefrästen Nullpunkts im CT-Bild registriert (ergänzende Abbildung 1f, d). mit FSLeyes (FMRIB Software Library)44. Nach der Ausrichtung wurde der Peak des geschmolzenen Bereichs für jeden Punkt bestimmt und räumliche Abweichungen (euklidischer Abstand) vom idealen Ort mit MATLAB 2023a (Mathworks) analysiert und mit den integrierten Funktionen quiver und imagesc aufgezeichnet.

Mit einem 1,46-MHz-Wandler und dem oben beschriebenen Hydrophon-Aufbau testeten wir die Reduzierung der 2,2-MPa-Beschallung durch sechs entgaste Weißbüschelaffen-Schädel und verglichen diese Werte mit Freifeldmessungen in entgastem Wasser. Im Durchschnitt über 6 erwachsene Weißbüschelaffen-Schädelkappen (in stereotaktischer Ebene geschnitten, beginnend an der Oberseite des Augenrückens, aber vollständig intakt dorsal davon) stellten wir fest, dass die Abweichung im Durchschnitt 47 % bei rasierter Kopfhaut und 44 % bei geradem Kopf betrug der Schädel und die daran befestigten Muskeln (35–42 Punkte wurden je nach Schädelgröße systematisch an jedem Schädel getestet und hatten einen Abstand von 2 mm). Daher haben wir den Durchschnittswert von 53 % verwendet, um unsere vorgegebenen Werte im gesamten Manuskript herabzusetzen. Unter Verwendung derselben Proben verglichen wir auch die Schwächungswirkung von Knochen ohne anhaftenden Muskel (an der Mittellinie) mit der durch den dicksten Teil des Schläfenmuskels, wo der Knochen auch am dicksten war (10 mm seitlich von der Mittellinie und 5 mm anterior). die interaurale Ebene). Dort, wo Knochen und Muskeln am dicksten waren, kam es zu einer zusätzlichen Schwächung von 2,5 %. Wenn ein abgetrennter Schläfenmuskel zwischen Schallkopf und Hydrophon platziert wurde, wurde kein messbarer Dämpfungseffekt beobachtet und dieser Effekt war daher allein auf die Knochendicke oder den Schädelwinkel zurückzuführen.

Die Ultraschallbehandlungen wurden transkraniell (bei intakter Haut, nur Haare entfernt) basierend auf der stereotaktischen Position angewendet, wobei x = 0, y = 0, z = 0 mm der Mitte zwischen der Mitte der Ohrbügel und der Ebene mit dem Boden der Augenhöhle entsprach Riegel. Die Marmoset-spezifische Stereotaxie wurde mit Rändelschrauben fest auf der RK-50 Marmoset-Grundplatte montiert. Anschließend wurden die Beschallungsorte basierend auf der gewünschten Position im stereotaktischen Raum festgelegt (z. B. Abb. 1b). Zur Co-Lokalisierung mit funktionellen und strukturellen Atlas-Landmarken im Gehirn von Weißbüschelaffen wurde die tFUS-Positionierungssoftware (MORPHEUS-Framework, FUS Instruments Incorporated, Toronto, ON, Kanada) in die Atlanten marmosetbrainmapping.org45 und marmosetbrainconnectome.org26 integriert. Zusammen mit den zytoarchitektonischen Grenzen, die aus dem Gehirnatlas des Paxinos-Weißbüschelaffens24 abgeleitet wurden, ermöglichte die Morpheus-Software eine genaue Positionierung des Wandlers in Bezug auf das Gehirn erwachsener Weißbüschelaffen.

Unmittelbar vor der Beschallung (< 1 Minute) wurden Mikrobläschen (Definity, Lantheus Medical Imaging, Billerica, MA, USA) über einen lateralen Schwanz- oder Saphena-Venen-Katheter verabreicht, um die BHS-Störung zu unterstützen. Mikrobläschenlösungen wurden direkt in den Katheteransatz injiziert; Um die Wahrscheinlichkeit einer vorzeitigen Zerstörung der Mikrobläschen zu verringern, wurde ein 26-Gauge-Katheter gewählt. Die Konzentration (20–400 μl/kg) der Mikrobläschen variierte je nach Experiment (nacheinander detailliert), aber alle Injektionen wurden in einer Stammlösung (100 μl Mikrobläschen/860 μl sterile Kochsalzlösung) in einer 1-ml-Spritze (Gewicht (kg)) zubereitet. × Mikrobläschenkonzertierung (ml/kg) × 9,6 = Injektionsvolumen (ml) für alle Experimente. Die Lösung wurde als Bolus injiziert und mit 200 μl steriler Kochsalzlösung gespült, um sicherzustellen, dass die Mikrobläschen das Volumen des Katheteransatzes freigaben.

Evans-Blau-Färbung und ein Gadolinium-basiertes MRT-Kontrastmittel (GBCA) wurden verwendet, um eine BHS-Störung zu verifizieren. Alle Wirkstoffe wurden unmittelbar nach der letzten Ultraschallbehandlung als Bolus injiziert (obwohl der Zeitpunkt der Injektion je nach Dauer der BHS-Störung und Clearance-Experimenten variierte, siehe unten). Evans Blau (E2129; Sigma-Aldrich Co., MO) wurde allen Tieren intravenös als Bolus in einer Dosis von 2 μl/g in 2 %iger Lösung, zubereitet in sterilem Wasser, injiziert. Gadolinium (GadavistTM, Gadobutrol; Bayer Healthcare Pharmaceuticals, Leverkusen, Deutschland) wurde in 200 μl steriler Kochsalzlösung hergestellt und in einer Dosis von 100 μl/kg allen Weißbüschelaffen außer Weißbüschelaffen G (200 μl/kg) und SP (600 μl/kg) injiziert. kg).

Weißbüschelaffe B erhielt zwei Ultraschallbehandlungen im parietalen Kortex, um den relativen Unterschied in der Größe der BHS-Störung als Funktion der Mittenfrequenz des Wandlers zu bestimmen (Abb. 1c). Aufgrund früherer Berichte über eine zuverlässige BHS-Störung bei Ratten (die eine ähnliche Schädeldicke und Gehirngröße wie Weißbüschelaffen haben) bei ~500 kHz und ihrer Harmonischen ~1,5 MHz29 haben wir sowohl einen 515-kHz- als auch einen 1,46-MHz-Wandler getestet, aber wie wir weiter zeigen werden Die Größe der Öffnung ab 1,46 MHz war für die in dieser Studie beschriebenen Experimente besser geeignet und daher wurden alle anderen Beschallungen bei 1,46 MHz durchgeführt. Die einzige bei 515 kHz durchgeführte Beschallung erfolgte im linken parietalen Kortex von Weißbüschelaffe B (1 MPa befohlen, reduziert ~0,5 MPa, 30 ms Burst-Dauer, 1000 ms Burst-Periode, 90 Bursts, 400 μl/kg Mikrobläschendosis). Der rechte parietale Kortex desselben Tieres wurde mit einem 1,46-MHz-Wandler beschallt (1,70 MPa (reduziert), 30 ms Burst-Dauer, 1000 ms Burst-Periode, 90 Bursts, 400 μl/kg Mikrobläschendosis). Eine Störung der Blut-Hirn-Schranke wurde durch ex vivo-Färbung mit Evans-Blau berichtet.

Für dieses Experiment erhielten die Weißbüschelaffen SG, NE und T jeweils fünf oder acht kortikale Ultraschallbehandlungen (Bereich 8a, 4ab, MIP und V2) mit einem 1,46-MHz-Wandler. Abbildung 2 zeigt die Beschallungsorte und die damit verbundenen verringerten Schalldrücke. Für Marmoset SG wurde der Schalldruck moduliert, wobei die folgenden Parameter konstant blieben: Burst-Dauer = 30 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 90, Mikrobläschendosis = 400 μl/kg. Basierend auf den von Marmoset SG gewonnenen Informationen wurden Marmoset NE und T bei niedrigeren Schalldrücken beschallt, wobei die folgenden Parameter konstant blieben: Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 60, Mikrobläschendosis = 200 μl/ kg. Der Zweck dieses Experiments war dreifach: (1) den minimalen Schalldruck zum Öffnen der BHS bei einem Weißbüschelaffen bei 1,46 MHz zu bestimmen, (2) die Größe/Form der BHS-Störung als Funktion des Schalldrucks zu bestimmen und (3) Bestimmen Sie den Druck, bei dem Schäden auftreten. Bei allen drei Tieren wurde eine Störung der Blut-Hirn-Schranke durch in vivo GBCA-verstärkte MRT und Evans-Blau-Färbung ex vivo berichtet. Der Gewebeschaden wurde mithilfe der H&E-Färbung beurteilt (siehe unten).

Die Weißbüschelaffen NE und T wurden verwendet, um die minimale Mikrobläschendosis zu bestimmen, die zum Öffnen der BHS erforderlich ist. Jedes Tier wurde viermal beschallt (Bereich 8a, 4ab, MIP und V2), mit unterschiedlichen Mikrobläschendosierungen von 0 bis 200 μl/kg (Abb. 3 zeigt Dosierungen an bestimmten Stellen), wobei die folgenden Parameter konstant blieben: verringerter Schalldruck = 1,17 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 60. Zwischen Ultraschallbehandlungen und Mikrobläschen-Injektionen vergingen zehn Minuten, um die Störeffekte zirkulierender Mikrobläschen zu reduzieren. Beachten Sie, dass Weißbüschelaffen NE und T sowohl am Schalldruck- (oben) als auch am Mikrobläschen-Dosierungsexperiment teilgenommen haben (allerdings an getrennten Beschallungsstellen, mit Ausnahme des linken 8aD, das beide Experimente beeinflusste). Bei beiden Tieren wurde eine BHS-Störung durch in vivo GBCA-verstärkte MRT und ex vivo Evans-Blau-Färbung festgestellt. Der Gewebeschaden wurde mittels H&E-Färbung beurteilt.

Weißbüschelaffen T und M erhielten vier Ultraschallbehandlungen (Parietalbereiche PFG rechts, PE rechts, PE links und PFG links; wenn auch leicht unterschiedliche Orte, siehe Abb. 4 für affenbezogene Standorte), um die Fähigkeit zu bestimmen, die BHS anschließend an mehreren Stellen zu öffnen eine einzelne Bolusinjektion von Mikrobläschen. Abbildung 4 zeigt getrennte Beschallungsorte, beginnend bei 30, 60, 90, 120, 240 und 480 s nach einer Bolusinjektion von 200 μl/kg Mikrobläschen. Für alle Standorte wurde ein 1,46-MHz-Wandler verwendet, wobei die Parameter konstant blieben: verringerter Schalldruck = 1,17 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 60. BHS-Störungen wurden durch in vivo GBCA-verstärkte Messungen gemeldet MRT (beachten Sie, dass die MRT-Sequenz für Weißbüschelaffen T und M variierte, beide jedoch deutlich einen T1-gewichteten GBCA-Kontrast zeigten) und Ex-vivo-Evans-Blau-Färbung. Der Gewebeschaden wurde mittels H&E-Färbung beurteilt. Frequenzspektren aus akustischen Emissionen wurden mithilfe einer schnellen Fourier-Transformation erzeugt und über Impulse gemittelt (ergänzende Abbildung 2).

Marmoset SP erhielt zwei Ultraschallbehandlungen (links: 6DC; rechts: Bereich 6VA). Im Gegensatz zu den vorherigen Experimenten wurden die Beschallungen nicht symmetrisch durchgeführt – die Beschallungen der rechten Hemisphäre wurden lateral von den Beschallungen der linken Hemisphäre verschoben, um zusätzlich den Schädelwinkel entlang der medial-lateralen Achse zu variieren (Abb. 5 für die Positionen). Bei beiden Beschallungen wurden die folgenden Parameter mit einem 1,46-MHz-Wandler verwendet: verringerter Schalldruck = 1,70 MPa, Burst-Dauer = 30 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 90, Mikrobläschen-Dosierung = 400 μl/kg. Zur Berechnung des Schädelwinkels wurde ein hochauflösendes Computertomographiebild (CT) aufgenommen und im Schablonenraum mitregistriert25. Die Größe der BBB-Störung wurde mit dem FIJI-Softwarepaket46 auf der Grundlage der Evans-Blue-Färbungsmikroskopiebilder berechnet (Abb. 5e).

Weißbüschelaffen SK erhielten insgesamt 8 Ultraschallbehandlungen (Bereich 8a, 4ab, MIP und V2 bilateral). In der linken Hemisphäre wurde der Arbeitszyklus von 5 bis 20 ms variiert (Abb. 6 für den Arbeitszyklus je nach Standort), wobei die folgenden Parameter mit einem 1,46-MHz-Wandler konstant gehalten wurden: verringerter Schalldruck = 1,70 MPa, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Stöße = 60, Mikrobläschen-Dosierung = 400 μl/kg. In der rechten Hemisphäre wurde die Anzahl der Bursts von 5 bis 40 Bursts variiert (Abb. 6 für die Anzahl der Bursts nach Ort), wobei die folgenden Parameter mit einem 1,46-MHz-Wandler konstant gehalten wurden: reduzierter Schalldruck = 1,70 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Mikrobläschen-Dosierung = 400 μl/kg. Weißbüschelaffe M erhielt insgesamt 6 Ultraschallbehandlungen mit dem gleichen 1,46-MHz-Wandler, jedoch mit reduzierten Parametern und Mikrobläschendosis als Weißbüschelaff SK: reduzierter Schalldruck = 1,17 MPa, Burst-Periode = 1000 ms, Mikrobläschendosis = 200 μl/kg. In der linken Hemisphäre (Standorte in Abb. 6) variierte die Burst-Dauer zwischen 5 und 20 ms; In der rechten Hemisphäre variierte die Anzahl der Ausbrüche zwischen 5 und 20 Ausbrüchen (beachten Sie auch hier, dass die MRT-Sequenz für Weißbüschelaffen SK und M variierte, beide jedoch deutlich einen T1-gewichteten GBCA-Kontrast zeigten).

Marmoset G erhielt eine einzelne Beschallung (Bereich 8a, rechte Hemisphäre) mit einem 1,46-MHz-Wandler und den folgenden Parametern: reduzierter Schalldruck = 0,95 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 60, Mikrobläschendosis = 100 μl/kg. Eine Störung der Blut-Hirn-Schranke wurde durch in vivo GBCA-verstärkte MRT gemeldet. Um zu bestimmen, wie lange die BHS offen blieb, wurden Marmoset G 2, 5 und 8 Stunden nach der Ultraschallbehandlung drei Bolusinjektionen eines GBCA verabreicht. Anatomische MPRAGE-Bilder (Sequenz siehe unten) wurden stündlich erfasst, um die Veränderungen in der Größe und Intensität des GBCA zu bestimmen, der die BHS in das Parenchym passiert. Eine Störung der Blut-Hirn-Schranke wurde auch durch Evans-Blau gemeldet, das unmittelbar nach der letzten Ultraschallbehandlung injiziert wurde. Der Gewebeschaden wurde mittels H&E-Färbung, begleitet von IBa1, NeuN und DAPI, beurteilt. Marmoset M erhielt auch eine einzige Ultraschallbehandlung in Bereich 8a (reduzierter Schalldruck = 1,17 MPa, Burst-Dauer = 20 ms, Burst-Periode = 1000 ms, Anzahl der Bursts = 60, Mikrobläschendosis = 200 μl/kg), es wurde jedoch GBCA verabreicht nach 2 Stunden, dann ein viel längerer Zeitraum von 2 Wochen nach der Beschallung. Angesichts der für das Experiment notwendigen Überlebenszeit (2 Wochen) erhielt Marmoset M kein Evans-Blau.

Die gesamte Bildgebung (MRT und CT) wurde am University of Pittsburgh Brain Institute durchgeführt. Für die MRT wurde ein 9,4 T 30 cm horizontaler Bohrscanner (Bruker BioSpin Corp, Billerica, MA) verwendet, ausgestattet mit einer Bruker BioSpec Avance Neo-Konsole und dem Softwarepaket Paravision-360 (Version 3.2; Bruker BioSpin Corp, Billerica, MA). und eine kundenspezifische 17-cm-Hochleistungsgradientenspule (Resonance Research Inc, Billerica, MA) mit einer Gradientenstärke von 450 mT/m. Um eine BHS-Störung in vivo zu erkennen, wurde eine MRT an Weißbüschelaffen B, SG, NE, T, M, SK, SP und G zusammen mit einem intravenösen Kontrastmittel (Gadolinium) durchgeführt, das nach den Ultraschallbehandlungen (innerhalb von 1 Minute nach der letzten Ultraschallbehandlung) injiziert wurde (mit Ausnahme von Marmoset E zur Bestimmung der Dauer der BHS-Störung) und vor der MRT (die MRT begann innerhalb von 20 Minuten nach dem Transfer des Tieres aus dem FUS, einschließlich Scannervorbereitungen einschließlich Lokalisierung und Magnetfeldanpassung). Die Hochfrequenzübertragung erfolgte mit einer kundenspezifischen Spule mit 135 mm Innendurchmesser und für den Hochfrequenzempfang wurde eine hauseigene 8-Kanal-Phased-Array-Spule speziell für Weißbüschelaffen verwendet. Weißbüschelaffen wurden in der Sphinxposition abgebildet, mit einem maßgeschneiderten 3D-gedruckten Helm zur Kopffixierung und einer Anästhesiemaske zur Inhalation von Isofluran. Eine T1-gewichtete FLASH-Sequenz (Fast Low Angle Shot) wurde verwendet, um die daraus resultierende Verkürzung der T1-Relaxationszeiten durch die Kontrastmittel, die über die BHS-Störung in das Parenchym gelangen, zu erkennen. Für jedes Tier wurden drei Scans (später gemittelt) mit den folgenden Parametern erfasst: TR = 25 ms, TE = 8 ms, Sichtfeld = 35 × 35 × 26 mm, Matrixgröße = 117 × 117 × 87, Voxelgröße = 0,299 × 0,299 × 0,299 mm, Bandbreite = 200 kHz, Flipwinkel = 25 Grad, Gesamtscanzeit = 9 min, 2 s. Für Weißbüschelaffen G und M wurde anstelle der FLASH-Sequenz eine durch Magnetisierung vorbereitete Rapid-Gradienten-Echo-Sequenz (MPRAGE) verwendet, da die systemische GBCA longitudinal additive Auswirkungen auf den dynamischen Signalkontrast hat. Bei der MPRAGE-Sequenz wird dieser additive Effekt durch den zusätzlichen Inversionsimpuls reduziert. Die MPRAGE-Sequenz wurde mit den folgenden Parametern erfasst: TR = 6000 ms, TE = 3,42 ms, Sichtfeld = 42 × 35 × 25 mm, Matrixgröße = 168 × 140 × 100, Voxelgröße = 0,250 × 0,250 × 0,250 mm, Bandbreite = 50 kHz, Flipwinkel = 14 Grad, Gesamtscanzeit = 20 Minuten, 6 Sekunden.

Um den Schädelwinkel relativ zum Ultraschallwandler genau zu quantifizieren, wurde ein CT auf Marmoset SP am University of Pittsburgh Brain Institute an einem Kleintier-CT (Si78; Bruker BioSpin GmbH, Ettlingen, Deutschland) aufgenommen, das mit dem Softwarepaket Paravision-360 (Version 3.1; Bruker BioSpin Corp, Billerica, MA). Unter Verwendung eines 1-mm-Aluminiumfilters mit niedriger Dosis wurde ein 200 × 200 × 200 μm (Sichtfeld = 79,6 × 81,1 mm) CT mit einer „Step-and-Shoot“-Methode (0,6-Grad-Gantry-Schritt) aufgenommen und mithilfe der gefilterten Rückseite rekonstruiert Projektionsalgorithmus. Die MRT- und Schnittmikroskopiebilder wurden dann mithilfe der in DSIstudio47 bereitgestellten 2D-zu-3D-Registrierung ausgerichtet.

Die Quantifizierung der „Öffnungsgröße“ der BHS wurde mit den Post-Ultraschall-MRTs der Weißbüschelaffen SG, SK, NE, T, G und M berechnet, indem das Volumen des extravasierten GBCA in der Mitte des jeweiligen Ultraschallpunkts im Draw Dataset Plugin von AFNI gemessen wurde48. Die resultierenden Volumina wurden mit 3dROIstats von AFNI berechnet und zur weiteren statistischen Analyse über Tiere und Parameter hinweg in MATLAB 2023a (Mathworks) geladen. Wir führten eine lineare Regression („fitlm“- und „stepwiselm“-Funktionen, Statistics and Machine Learning Toolbox) mit Eingabevariablen wie verringertem Schalldruck, Mikrobläschendosis, Anzahl der Ausbrüche, Ausstoßzeitraum und Tiergewicht durch. Das berechnete Volumen an extravasiertem GBCA war die abhängige Variable. Es wurden drei Gesamtregressionsanalysen durchgeführt: (1) lineare Regression der oben genannten Variablen mit dem Extravasationsvolumen als abhängige Variable, (2) dieselben, jedoch als schrittweise Regression, und (3) dieselben unabhängigen Variablen in einer linearen Regression, aber mit binarisiertem Extravasationsvolumen (d. h. 1 = Gadolinium-Kontrast erkannt, 0 = kein GBCA-Kontrast erkannt).

Nach der In-vivo-MRT-Aufnahme (und 6–8 Stunden nach der Ultraschallbehandlung) wurden alle neun Krallenaffen zur histologischen Untersuchung mit Pentobarbital-Natrium und Phenytoin-Natrium-Lösung (100 mg/kg) eingeschläfert. Die transkardiale Perfusion wurde mit 4 % Paraformaldehyd durchgeführt. Die Gehirne wurden entnommen, nachfixiert und 3–5 Tage lang in 30 %iger Saccharose kryogeschützt. Die Gehirne von Weißbüschelaffen wurden mit einem Kryostaten (Leica CM1950, Deer Park, IL, USA) bei 30 μm koronal geschnitten und bis zur weiteren Verwendung in einer Kryoschutzmittellösung mit 15 % Glycerin und 15 % Ethylenglykol bei –20 °C gelagert. Für die Evans-Blau-Fluoreszenz wurden Schnitte auf Superfrost-Objektträger (Fisher Scientific) montiert und unter einem AxioImager M2-Epifluoreszenzmikroskop (Car Zeiss, White Plains, NY, USA) sichtbar gemacht. Für die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) wurden Schnitte auf einen Superfrost-Objektträger montiert und mit einem H&E-Färbekit (Nr. 3502 Vector Laboratories, Newark, CA, USA) gemäß den vom Hersteller empfohlenen Verfahren gefärbt. Die Bilder wurden mit einem AxioImager M2-Mikroskop (Carl Zeiss) aufgenommen. Für die Immunfluoreszenzfärbung wurden schwimmende Schnitte in Blockierungspuffer (2 % Eselserum und 0,2 % Triton Adaptermolekül 1 – 1:500; #019-19741 Wako Chemicals) und NeuN (Fox-3 – 1:500; #MAB377 MilliporeSigma) bei 4 °C. Nach dem Waschen mit PBS wurden die Schnitte mit fluoreszierenden Sekundärantikörpern, Alexa Fluor 488-konjugiertem Esel-Anti-Kaninchen-IgG (Invitrogen) und Alexa Fluor 647-konjugiertem Esel-Anti-Maus-IgG (Invitrogen) inkubiert. Zur Kernfärbung wurden die Schnitte mit DAPI (4',6-Diamidin-2'-phenylindoldihydrochlorid – Invitrogen) gegengefärbt. Die Bilder wurden mit einem konfokalen LSM900-Mikroskop (Carl Zeiss) unter Verwendung eines 10-fachen Objektivs bei einer Auflösung von 1024 × 1024 Pixel und einer Z-Schrittgröße von 1 μm Dicke aufgenommen.

Zur genaueren Schadensbeurteilung38 wurde bei Marmoset G und SK eine zusätzliche TUNEL-Färbung (PK101; FD NeuroTechnologies, Columbia, MD USA) durchgeführt. CD68 (MCA1957; Bio-Rad, Hercules, CA, USA) und CD206 (ab64693; abcam, Waltham, MA, USA) wurden auch zum Färben von Scheiben von Marmoset G als Marker für aktivierte phagozytische Mikroglia verwendet. Zur Identifizierung von Astrozyten wurde eine Immunfärbung gegen GFAP (C9205; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) verwendet. Lektin (DL-1174-1; Vector Laboratories, Newark, CA USA) und der Kernmarker DAPI (62248; Thermo Fisher Scientific) wurden zur Visualisierung von Blutgefäßen verwendet.

Parameter (Schalldruck, Mikrobläschendosis, Anzahl der Stöße, Ausbruchsdauer) wurden variiert und an mehreren Tieren unterschiedlichen Alters, Gewichts und Geschlechts getestet (Ergänzungstabelle 1). Das BHS-Öffnungsvolumen wurde mithilfe der GBCA-In-vivo-MRT unter Verwendung des Draw Dataset Plugins von AFNI und 3dROIStats quantifiziert. Statistiken wurden mit einer Kombination aus internem Code und integriertem Code aus der Statistics and Machine Learning Toolbox von MATLAB durchgeführt, insbesondere mit den Funktionen „fitlm“ und „stepwiselm“. Die lineare Regression wurde tierübergreifend durchgeführt und verwendete alle verschiedenen Parameter sowie das Gewicht des Tieres.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Daten sind auf begründete Anfrage der Autoren erhältlich. Quelldaten für Abb. 9 finden Sie in den Zusatzdaten 1.

Der Code ist auf begründete Anfrage der Autoren verfügbar.

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Wir möchten Brianne Stien, Lauren Dubberly und Dr. Julia Oluoch für die Tierpflege und -vorbereitung danken. Diese Arbeit wurde vom National Institute of Neurological Disorders and Stroke der National Institutes of Health unter der Fördernummer R21NS125372 (DJS) und vom Pennsylvania Department of Health Commonwealth Universal Research Enhancement (CURE) Tobacco Appropriation Funds – Phase 18 (SAP 4100083102; ACS). Für den Inhalt sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offiziellen Ansichten der National Institutes of Health wieder.

Abteilung für Neurobiologie, Universität Pittsburgh, Pittsburgh, PA, USA

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TVP, DS, SC, AA, YM, ACS und DJS konzipierten und führten Forschungsarbeiten durch. TVP, DS, SC und DJS analysierten Daten. TVP und DJS haben das Manuskript geschrieben. TVP, DS, SC, AA, YM, ACS und DJS haben das Manuskript bearbeitet.

Korrespondenz mit David J. Schaeffer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Karli Montague-Cardoso und Joao Valente.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Parks, TV, Szuzupak, D., Choi, SH. et al. Nichtinvasive Störung der Blut-Hirn-Schranke beim Weißbüschelaffen. Commun Biol 6, 806 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-05185-3

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Eingegangen: 21. November 2022

Angenommen: 26. Juli 2023

Veröffentlicht: 02. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-05185-3

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