Ein neuartiges Kapsidproteinnetzwerk ermöglicht die charakteristische innere Membranstruktur von Marseilleviridae-Riesenviren

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21428 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Marseilleviridae ist eine Familie von Riesenviren, die eine charakteristische innere Membran mit Ausstülpungen unter den Ikosaederspitzen aufweisen. Allerdings sind solch große Objekte mit einem maximalen Durchmesser von 250 nm technisch schwierig mit der Kryo-Elektronenmikroskopie mit einer Auflösung im Subnanometerbereich zu untersuchen. Hier haben wir den Nutzen von 1 MV Hochspannungs-Kryo-EM (Kryo-HVEM) für die Einzelpartikelstrukturanalyse (SPA) von Riesenviren unter Verwendung von Tokyovirus, einer Art von Marseilleviridae, getestet und die Kapsidstruktur mit einer Auflösung von 7,7 Å aufgedeckt. Das Kapsid, das die virale DNA umschließt, bestand hauptsächlich aus vier Schichten: (1) Hauptkapsidproteine (MCPs) und Pentonproteine, (2) Nebenkapsidproteine (mCPs), (3) Gerüstproteinkomponenten (ScPCs) und (4) interne Membran. Die mCPs zeigten ein neuartiges Kapsidgitter bestehend aus acht Proteinkomponenten. ScPCs, die die ikosaedrischen Spitzen verbinden, unterstützten die Bildung der Membranextrusionen und wirken möglicherweise wie Maßbandproteine, die bei anderen Riesenviren beobachtet wurden. Es wurde vermutet, dass die Dichte auf dem MCP-Trimer Glykoproteine umfasst. Dies ist der erste Versuch eines Kryo-HVEM SPA. Wir stellten fest, dass die Haupteinschränkungen das Fehlen einer automatisierten Datenerfassung und Softwareunterstützung für die Erfassung und Verarbeitung und damit eine erreichbare Lösung sind. Die Ergebnisse ebnen jedoch den Weg für den Einsatz von Kryo-HVEM zur Strukturanalyse größerer biologischer Proben.

Bei den „Riesenviren“ handelt es sich um außergewöhnlich große Viren, die größer sind als kleine Bakterien1. Sie haben außerdem ein viel größeres Genom (> 100 Kilobasen (kb)) als andere Viren und enthalten viele Gene (> 50 Gene), die in anderen Viren nicht vorkommen2. Eines der Merkmale dieser Viren ist, dass sie doppelsträngige DNA besitzen, die in einer Lipiddoppelschicht eingekapselt ist3. Diese großen DNA-Viren werden heute taxonomisch in den Stamm Nucleocytoviricota4 eingeteilt, wurden jedoch in der Vergangenheit als nukleozytoplasmatisches großes DNA-Virus (NCLDV) bezeichnet. NCLDVs sind eine ausgedehnte Gruppe großer Viren, die doppelsträngige DNA besitzen und auf unterschiedliche Wirts-Eukaryoten abzielen5. NCLDVs bestehen aus mehreren Familien, darunter den Asfarviridae, Ascoviridae, Iridoviridae, Marseilleviridae, Mimiviridae, Phycodnaviridae und Poxviridae, sowie nicht klassifizierten Viren wie Cedratviren, Faustoviren, Medusaviren, Mininucleoviridae, Molliviren, Orpheoviren, Pacmanviren, Pandoraviren und Pithoviren6. Auch heute noch werden eine Vielzahl von NCLDVs aus der ganzen Welt isoliert und untersucht. Basierend auf den gemeinsamen Merkmalen dieser Viren wurde eine neue Ordnung, Megavirales, vorgeschlagen7. NCLDVs weisen abhängig von der Art verschiedene Arten von Formen auf2. Asfarviridae, Ascoviridae, Iridoviridae, Marseilleviridae, Mimiviridae, Phycodnaviridae, Faustoviren, Medusaviren, Pacmanviren und Mininucleoviridae weisen eine ikosaedrische Form auf. Poxviridae weist eine Ziegelform auf. Cedratviren, Molliviren, Orpheoviren, Pandoraviren und Pithoviren weisen eine Amphorenform auf. Auch die Größen variieren; Die amphorenförmigen Pithoviren sind mit einer Größe von mehr als 2 μm die größten der Riesenviren, es gibt jedoch erhebliche Unterschiede in den tatsächlichen Abmessungen8. Andererseits hat das ikosaedrisch geformte Mimivirus einen Durchmesser von etwa 500 nm (ohne die vom Kapsid ausgehenden Faserfilamente)9, und sein nächster bekannter Verwandter, das Cafeteriavirus, hat einen Durchmesser von etwa 300 nm10. Die ziegelsteinförmigen Pockenviren sind etwa 350 × 270 nm groß, die genauen Abmessungen sind jedoch unterschiedlich11. Andere ikosaedrische Viren sind etwa 260 nm für Medusavirus12,13, etwa 180 nm für Iridovirus14 und etwa 190 nm für PBCV-115. ASFV beträgt etwa 250 nm, ist aber kompliziert, da es eine externe Membran hat16.

Marseilleviridae ist eine Familie der neuen Ordnung der NCLDVs17, die ein hochkomplexes Genom von ca. 360 kb und eine Partikelgröße von ca. 250 nm aufweisen. Der erste Vertreter, das Marseillevirus, wurde 2007 durch Kultivierung einer Wasserprobe aus einem Kühlturm in Paris, Frankreich, isoliert18. Derzeit gehören Cannes-8-Virus, Melbournevirus, Marseillevirus, Tokyovirus, Port-Miou-Virus, Lausannevirus, Noumeavirus, Insectminevirus, Tunisvirus, brasilianischer Marseillevirus, Goldmuschel-Marseillevirus und weitere Arten zu dieser Familie, und diese werden in fünf Abstammungslinien von A bis klassifiziert E19,20. Mehrere Studien haben auch über das Vorkommen von Marseilleviridae beim Menschen berichtet21,22,23,24. Es gibt jedoch Kontroversen im Zusammenhang mit Marseillevirus-Infektionen beim Menschen, da andere Studien keine Beweise gezeigt haben25,26. Das Melbournevirus, eines der Marseilleviridae der Linie A27, wurde zuvor mittels Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) und Einzelpartikelanalyse (SPA) mit einer Auflösung von 26 Å analysiert28. Es zeigt das ikosaedrische Kapsid mit einer Triangulationszahl von T = 309, zeigt die charakteristische innere Membran im Inneren des Kapsids, die direkt unter den Scheitelpunkten hervorsteht, und den einzigartigen Körper mit großer Dichte im Inneren des Nukleoids. Das Tokyovirus ist das erste Marseilleviridae, das 2016 in Asien isoliert wurde, und wird in die Linie A29 eingeordnet. In dieser Studie wurde das Tokyovirus verwendet, um die charakteristische Kapsidstruktur der ikosaedrischen Marseilleviridae zu untersuchen.

Nur wenige Studien haben die Kapsidstruktur großer ikosaedrischer Viren im Detail aufgeklärt. Eine elektronenmikroskopische Studie vor einem halben Jahrhundert zeigte, dass das große ikosaedrische Viruskapsid aus 20 bzw. 12 Sätzen von Trisymmetronen und Pentasymmetronen besteht30,31, obwohl diese Viren nicht als NCLDVs klassifiziert sind. Jedes davon ist ein Cluster von Kapsomeren, die aus Pseudohexameren bestehen. In den letzten Jahren wurden die Strukturen vieler Viren mit hoher Auflösung durch den Einsatz von Kryo-EM SPA zur Bestimmung der Gesamtstruktur32, der Dynamik33,34 und des Zusammenbaus35 aufgedeckt. Allerdings stellen die großen ikosaedrischen Viren allein aufgrund ihrer Größe besondere Herausforderungen für die hochauflösende Kryo-EM dar, was der Probenvorbereitung, der Datenerfassung und den Bildrekonstruktionstechniken starke Grenzen setzt. Eine harte Grenze ist eine Grenze, die nicht unter Verwendung derselben Bedingungen überwunden werden kann, z. B. der Partikelanzahl pro Mikroaufnahme oder der durch die Nyquist-Frequenz vorgegebenen Auflösungsgrenze. Eine weiche Grenze kann überwunden werden, z. B. durch das Sammeln weiterer mikroskopischer Aufnahmen, eine harte Grenze jedoch nicht. Daher wurden zunächst verschiedene Methoden, darunter Kryo-Elektronentomographie, Rasterelektronenmikroskopie und Rasterkraftmikroskopie, mit Kryo-EM kombiniert und die Struktur von Riesenviren untersucht9,36. Die verschiedenen Methoden, die zur Untersuchung von Riesenviren eingesetzt wurden, wurden bereits zuvor untersucht37. Im Jahr 2019 wurde jedoch die Struktur des Paramecium bursaria chlorella Virus 1 (PBCV-1) mit einer Auflösung von 3,5 Å15 bzw. die Struktur des Afrikanischen Schweinepestvirus (ASFV) mit einer Auflösung von 4,1 Å16 durch die Verwendung von Kryo-EM SPA berichtet. Für diese Kryo-EM-SPA der großen ikosaedrischen Viren mit hoher Auflösung wurden üblicherweise Mikroskope mit einer Beschleunigungsspannung von 300 kV verwendet. Diese Berichte verwenden jedoch eine Methode namens „blockbasierte Rekonstruktion“38, um diese Auflösungen zu erreichen, die sich auf Unterabschnitte („Blöcke“) des Virus konzentriert, um eine lokale Defokussierungsverfeinerung zu ermöglichen, was zu Rekonstruktionen mit höherer Auflösung führt. In diesen Berichten wurde gezeigt, dass die Kapside von PBCV-1 und ASFV aus einem „Haupt“-Kapsidprotein (MCP) und insgesamt vierzehn Arten (PBCV-1) oder vier Arten (ASFV) von „Neben“-Kapsidproteinen bestehen (mCP). Das MCP von PBCV-1 und ASFV umfasst doppelte „Jelly Roll“-Motive, die jeweils aus acht β-Strängen bestehen39. Die Verbindungsschleifen in den Motiven und ihre Glykosylierungsstellen verleihen diesen Viren einzigartige Funktionen. Die mCPs bilden ein hexagonales Netzwerk, um den Raum zwischen den pseudohexagonalen MCP-Trimeren zu füllen, was dazu beiträgt, die Kapsidstruktur stabil zu halten. Darüber hinaus besitzen PBCV-1 und ASFV ein mCP, das als „Maßband“-Protein bezeichnet wird. Dabei handelt es sich um ein langes filamentöses Protein, das sich von einem Pentasymmetron zu einem benachbarten Pentasymmetron entlang der Trisymmetronkante erstreckt. Es wurde vorgeschlagen, dass die Länge dieses Maßbandproteins die Kapsidgröße bestimmt40.

Hier konzentrieren wir uns auf die Einzelpartikelrekonstruktion des gesamten Tokiovirus mithilfe von 1 MV Kryo-HVEM (Hochspannungselektronenmikroskopie). HVEM wurde ursprünglich entwickelt, um die erreichbare Auflösung durch kürzere Elektronenwellenlängen zu erweitern41. Der Hauptanwendungsschwerpunkt liegt derzeit bei dicken Proben, in die niedrigere Beschleunigungsspannungen nicht eindringen können42. Kryo-HVEM an biologischen Proben wurde bisher nicht für die Einzelpartikelanalyse beschrieben, und es wurden nur wenige Beispiele mit Tomographie gemeldet8,43,44. Bei dicken Proben (z. B. Tokyovirus mit einem maximalen Durchmesser von 250 nm) führt der Einfluss der Schärfentiefe zu einer internen Fokusverschiebung, wodurch die erreichbare Auflösung stark begrenzt wird45. Allerdings kann eine Erhöhung der Beschleunigungsspannung (Verkürzung der Wellenlänge der emittierten Elektronen) die Schärfentiefe erhöhen und die (elektronen-)optischen Bedingungen in dicken Proben verbessern. Die mit einer gegebenen Beschleunigungsspannung erreichbare Auflösung kann einfach mit der folgenden Formel berechnet werden, vorausgesetzt, dass alle Punkte innerhalb einer gegebenen Dicke als gleich fokussiert betrachtet werden können:

Dabei ist d die Auflösung, t die Probendicke (in diesem Fall der Partikeldurchmesser) und λ die Elektronenwellenlänge45. Bei Proben mit hoher Symmetrie, wie z. B. ikosaedrischen Viren, ist die Probendicke (oder -tiefe) funktionell äquivalent zum Partikeldurchmesser. Unter Verwendung von Gl. (1) Für eine 250 nm dicke Probe beträgt die Elektronenwellenlänge bei einer Beschleunigungsspannung von 300 kV 1,97 μm, sodass die theoretische Auflösungsgrenze bei ~ 9,9 Å liegt, wobei die gesamte Breite des Partikels die gleiche Fokustiefe aufweist (schwarze Kurven). in Abb. 1). Bei einer Beschleunigungsspannung von 1 MV beträgt die Elektronenwellenlänge 0,87 μm, so dass sich die theoretische Auflösungsgrenze rechnerisch auf 6,6 Å verbessert.

Der Tiefenschärfeeffekt in der Kryo-EM. Theoretische Auflösungsgrenzen aufgrund der Partikelgröße (Gl. 1) sind bei Beschleunigungsspannungen von 200, 300 und 1000 kV unter der Annahme einer gleichmäßigen Defokussierung aufgetragen (schwarze Kurven). Die Auflösungen, bei denen der Phasenfehler die theoretische maximale Auflösung einer Kryo-EM-Rekonstruktion begrenzt (Gleichung 2), sind bei Beschleunigungsspannungen von 200 kV, 300 kV und 1000 kV aufgetragen (rote Kurven). Gestrichelte vertikale Linie beim maximalen Durchmesser (250 nm) des Tokyovirus. Theoretische Auflösungsgrenzen beim maximalen Durchmesser des Tokyovirus werden auf eine Dezimalstelle genau angezeigt.

Die Berücksichtigung des Phasenfehlers in der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) des Signals46 ist eine weitere Schätzung zur Berechnung der maximal erreichbaren Auflösung (rote Kurven in Abb. 1) und kann wie folgt berechnet werden:

In diesem Fall verbessern sich die erreichbaren Auflösungen auf 5,9 Å bei 300 kV bzw. 4,0 Å bei 1 MV (rote Kurven in Abb. 1). Der Wert von 0,7 in Gl. (2)46 kann je nach Form eines Objekts variieren, unabhängig davon, ob es voll oder leer ist, und wurde nicht an realen Objekten wie dem Tokyovirus (maximaler Durchmesser von 250 nm) getestet. Frühere Diskussionen47,48,49 behandeln die Gleichungen zur Berechnung der Elektronenwellenlängen und zur Berücksichtigung relativistischer Effekte bei gegebenen Beschleunigungsspannungen, falls man die Mathematik weiter erforschen möchte. Natürlich beeinflussen viele andere Faktoren die maximale Auflösung, die mit experimentellen Daten erreicht wird. Ausgehend von der Schätzung haben wir versucht, die Struktur des gesamten Riesenviruspartikels mit einem maximalen Durchmesser von 250 nm bei höherer Auflösung mithilfe eines 1-MV-Kryo-HVEM zu klären, anstatt den blockbasierten Ansatz zu verwenden.

In dieser Studie haben wir zunächst 1 MV Kryo-HVEM für biologische SPA evaluiert. Anschließend führten wir eine SPA für ein ikosaedrisches Riesenvirus mit einem maximalen Durchmesser von 250 nm durch, das Tokiovirus. Dies führte zu einer dreidimensionalen (3D) Rekonstruktion von 7,7 Å ohne Verwendung der blockbasierten Rekonstruktionstechnik. Die Kryo-EM-Karte zeigte ein neuartiges Kapsidproteinnetzwerk (Abb. 4). Diese bestand aus MCP-Trimeren und Pentonproteinen, die die Oberfläche bedeckten, einer mCP-Schicht bestehend aus acht Proteinkomponenten und einem Gerüstproteinkomponenten-Netzwerk (Scaffold Protein Component, ScPC). Das Penton-Protein ist ein einzigartiges pentameres Protein, das sich in derselben Schicht wie das MCP befindet, jedoch nur an den fünffachen Eckpunkten. Die unter der mCP-Schicht vorhandenen und jeden Scheitelpunkt verbindenden ScPCs ermöglichen die interne Membranextrusion. Als solche könnten sie eine ähnliche Rolle spielen wie die Maßbandproteine, die die Partikelgröße bei NCLDV bestimmten. Eine zusätzliche Dichte über dem MCP-Trimer deutet darauf hin, dass sie ein Glykoprotein enthält und möglicherweise für die Wirt-Zell-Interaktion fungiert. Unsere Ergebnisse ebnen den Weg für ein besseres Verständnis dieser NCLDV-Familie und liefern darüber hinaus die erste Bewertung eines neuen Tools für die SPA riesiger biologischer Proben.

Während die auferlegte theoretische Auflösungsgrenze durch den Übergang zu höheren Beschleunigungsspannungen überwunden wird (Abb. 1)45,46, ist sie von geringem praktischen Nutzen, wenn andere Faktoren der erreichbaren Auflösung harte Grenzen setzen. Zu diesem Zweck untersuchten wir die Leistung des 1-MV-Kryo-HVEM (JEOL JEM-1000EES) mithilfe eines Pt-Ir-Films und führten eine Rotationsmittelung an einem berechneten Leistungsspektrum durch (Abb. 2A). Im 1D-Intensitätsdiagramm sind Thon-Ringe bis 1,81 Å deutlich sichtbar (Abb. 2B). Der Vergleich der Leistung des 1-MV-Kryo-HVEM mit einer LaB6-Elektronenkanone mit einem Hochleistungs-300-kV-Mikroskop mit einer thermischen Feldemissions-Elektronenkanone (in diesem Fall wurde ein Titan Krios G2 (Thermo Fisher Scientific) verwendet) ist ebenfalls von großer Bedeutung Interesse (Abb. S1). Als Kamera nutzen beide den Direktdetektor Gatan K2 Summit. Die Modulationsübertragungsfunktion (MTF) des 1-MV-Mikroskops ist im Zählmodus über den gesamten Ortsfrequenzbereich besser als die des 300-kV-Mikroskops, obwohl sie im Superauflösungsmodus innerhalb der Nyquist-Frequenz von 0,25 deutlich abfällt (Abb. S1A). . Die Detective Quantum Efficiency (DQE) ist für das 1-MV-Mikroskop im Zählmodus ähnlich überlegen, zeigt jedoch im Super-Resolution-Modus eine deutliche Reduzierung sowohl bei 1-MV- als auch bei 300-kV-Mikroskopen (Abb. S1B). Darüber hinaus zeigt die DQE des 1-MV-Kryo-HVEM einen Leistungsabfall von bis zu 40 % in den niedrigeren Ortsfrequenzen im Vergleich zum 300-kV-Kryo-EM. Ab einer Nyquist-Frequenz von 0,6 sind die beiden vergleichbar. In dieser Studie musste jedoch der Superauflösungsmodus verwendet werden, um die Effizienz der manuellen Probenahme der großen Viruspartikel zu erhöhen (Tabelle 1).

Leistung des Kryo-HVEM (JEOL JEM-1000EES), ausgestattet mit einem Gatan K2 Summit-Direktelektronendetektor, unter Verwendung einer Pt-Ir-Standardprobe. (A) Leistungsspektrum mit klaren Thon-Ringen. (B) Eine fokussierte Ansicht der Thon-Ringe. (C) 1D-Diagramm des Leistungsspektrums, berechnet mit dem Plugin „Radial Profile Extended“ von Fiji75.

Abbildung 3 zeigt die Gesamtstruktur des Tokyovirus, rekonstruiert mit RELION 3.150 mit auferlegter ikosaedrischer Symmetrie. Das Tokyovirus hat eine äußere Kapsidhülle, die aus MCP-Trimeren besteht, die in einer ikosaedrischen Form mit T = 309 (h = 7, k = 13) angeordnet sind (Abb. 3A). Unmittelbar unter der Außenhülle (MCP) befinden sich Schichten aus mCPs und ScPCs in dieser Reihenfolge, und die innere Membran speichert das virale Nukleoid innerhalb dieser Kapsidschichten (Abb. 3B–D). Bei der Extrusion der inneren Membran bildet die Membran mehrere Schichten (Sternchen in Abb. 3C). Die Nähe zum Scheitelpunkt des Kapsids aus dieser Extrusion erfolgt über die relativ großen mCPs und Materialien mit geringer Dichte (Pfeil in Abb. 3C). Im Vergleich zu MCP und mCPs sind die Dichten von ScPCs verschmiert, was die strukturelle Flexibilität der Komponente zeigt (Abb. 3C, D). Abbildung 3E zeigt die geschätzte lokale Auflösung der Kapsidschicht des Tokyovirus, geschnitten zur internen Visualisierung. Die höchste Auflösung wurde in der Schnittstelle zwischen MCP und mCPs gezeigt. Jeder Teil weist eine charakteristische Struktur auf, die durch sorgfältige Filterung und Segmentierung der Rekonstruktion besser sichtbar ist (Abb. 4). MCP-Trimere bedecken die gesamte Oberfläche des viralen Kapsids mit Ausnahme der fünffachen Scheitelpunkte (hellblau in Abb. 4A), wo die Pentons das Loch in den Scheitelpunkten verstopfen (Penton in Abb. 4A). mCPs können grob nach acht verschiedenen Komponenten klassifiziert werden, die wir vorübergehend als Kleber, Reißverschluss, Gitter, Zement, Träger und Pentasymmetronkomponente (PC) α, β und γ bezeichnet haben (Abb. 4B). Darüber hinaus befinden sich die ScPCs unterhalb der mCPs (gelb in Abb. 4). Diese Proteinkomponenten können aus mehreren mCP-Proteinen bestehen. Bei der aktuellen Auflösung und den aktuellen Annotationen des Genoms ist es nicht möglich, jedes Protein zu segmentieren oder jedes Protein anhand der Masse zu identifizieren. Wir haben diese Proteinkomponenten gerade anhand ihrer Form und Position identifiziert. Im Gegensatz zu den anderen mCPs bilden die ScPCs eine antiparallel verkettete Anordnung zwischen Pentasymmetronen entlang der Trisymmetron-Schnittstelle (gelb in Abb. 4). Möglicherweise aufgrund der ScPCs-Rahmen weist die innere Membran eine charakteristische Struktur auf, die unterhalb der fünffachen Eckpunkte nach außen extrudiert (Abb. 3B, C, grau in Abb. 4).

SPA 3D-Rekonstruktion des Tokyovirus mit einer Auflösung von 7,7 Å. (A) Eine Isoflächenansicht, gefärbt nach Radius, die die fünfzählige (schwarzes Fünfeck), dreizählige (schwarzes Dreieck) und zweizählige (schwarze Doppelträne) Symmetrieachse zeigt. H- und K-Indizes, die das Ikosaeder T = 309 angeben, sind enthalten. (B) Eine Querschnittsansicht mit durch Pfeile dargestellten Symmetrieachsen. (A,B) sind nach Radius in UCSF Chimera mit den folgenden Parametern gefärbt: blau, 910 Å; türkis, 1010 Å; grün, 1080 Å; gelb, 1125 Å; rot, 1200 Å und sind bei 2 σ dargestellt. (C) Ein zentraler Schnitt der 3D-Rekonstruktion. Asterisk zeigt einen mehrschichtigen Aufbau bei der Extrusion der Innenmembran. Der Pfeil zeigt schwache Dichten an, die den Scheitelpunkt des Kapsids und die innere Membranextrusion verbinden. (D) Fokussierte Ansicht des markierten Felds in (C), die die Abgrenzung zwischen Hauptkapsidprotein (MCP), Nebenkapsidprotein (mCP), Gerüstproteinkomponente (ScPC), interner Membran (IM) und Nukleokapsid (NC) zeigt. (E) lokale Auflösung des Kapsids, geschätzt durch das Blocres-Modul von Bsoft71, mit Fokus auf den oberen Kapsidrand, in Scheiben geschnitten, um die Visualisierung der inneren Dichte zu ermöglichen, und wird bei 3 σ angezeigt. Maßstabsbalken: (A–C) 50 nm, (D,E) 10 nm.

Segmentierung der Struktur des Tokyovirus. (A) Das vollständige Tokyovirus-Virion wurde ausgeschnitten, um jede Komponente zu zeigen. Einzelne Bestandteile des Virions; Angezeigt sind die Schicht des Hauptkapsidproteins (MCP) (hellblau), die Schicht des Nebenkapsidproteins (mCP) (blau), das Gerüstproteinkomponenten-Array (ScPC) (gelb) und die interne Membran (IM) (grau). Einzelne Segmente werden tiefpassgefiltert, um die Klarheit der Visualisierung zu verbessern. (B) Fokussierte Segmentierung von mCPs, ScPCs (gelb) und Penton (rotviolett) des Tokyovirus. Die in (A) blau gefärbten mCPs wurden anhand der Strukturen in 8 Komponenten eingeteilt, bestehend aus Gitterkomponente (LtC) (orange bis rot), Trägerkomponente (SuC) (königsblau), Zementkomponente (CmC) (himmelblau). blau), Reißverschlusskomponente (ZpC) (rosa), Kleberkomponente (GlC) (smaragdgrün) und 3 Pentasymmetronkomponenten (PC-α, β und γ) (lila, hellgrün und cyan). Die Isofläche ist bei 2 σ dargestellt.

Wir segmentierten die Tokyovirus-Rekonstruktion und extrahierten und klassifizierten die mCPs dann anhand ihrer strukturellen Merkmale und Anordnungen in acht Arten von Proteinkomponenten (Abb. 4B). Sie werden als Gitterkomponente (LtC) (orange bis rot in Abb. 4B), Stützkomponente (SuC) (königsblau in Abb. 4B), Zementkomponente (CmC) (himmelblau in Abb. 4B) und Reißverschlusskomponente bezeichnet (ZpC) (rosa in Abb. 4B) und die Kleberkomponente (GlC) (smaragdgrün in Abb. 4B) sowie drei Pentasymmetron-Komponenten von α, β und γ (PC-α, β und γ) (lila, hellgrün bzw. cyan in Abb. 4B). Das von mCPs gebildete netzförmige Dreieck besteht aus drei trapezförmigen Einheiten, die aus fünf Komponenten bestehen: LtC, SuC, ZpC, CmC und GlC, und diese Trapeze werden durch eine Drehung um 120° um die dreizähligen Rotationsachsen verbunden. Diese Proteinkomponenten sind am Rand des Dreiecks weiter mit PC-β und PC-γ verbunden.

Das LtC (orange bis rot in Abb. 4B) bildet eine wellenförmige Struktur entlang der Lücke der MCP-Trimere (orange bis rot in Abb. 4B). Diese Wellenform wiederholt sich entsprechend der Anzahl der darüber jeweils vorhandenen MCP-Trimere. Es bildet die Basis der trapezförmigen Einheit. Unter der von LtCs gebildeten Netzwerkstruktur bildet der SuC (königsblau in Abb. 4B) eine Brücke zwischen mehreren LtCs (Abb. 4B). Es verbindet auch die beiden ScPC-Paare (gelb in Abb. 5C) um die Membranextrusionen herum und bildet ein dreidimensionales ScPC-Gerüst, das die innere Membran umgibt (Abb. 5C). Innerhalb des Trisymmetrons verbinden die CmCs (himmelblau in Abb. 4B) die drei trapezförmigen Einheiten, indem sie die Enden der LtCs verbinden, sich von der dreizähligen Achse in Richtung des zugehörigen Pentasymmetrons erstrecken und an der ScPC-Kante enden. Zwei Proteinkomponenten, ZpC und GlC (rosa und smaragdgrün in Abb. 4B), sind an der Verbindung benachbarter Trisymmetrons beteiligt und verlaufen direkt über dem ScPC-Array (Abb. 5A, B). Die GlCs befinden sich an der Grenze zwischen benachbarten Trisymmetronen und scheinen diese zu verkleben. Die ZpCs füllen die Lücken zwischen den LtCs an den Trisymmetron-Grenzflächen und verzahnen sich mit den GlCs wie die Zähne eines Reißverschlusses.

Untersuchung des Gerüstproteinkomponentennetzwerks zwischen der inneren Membran und der Kapsidhülle. (A) Plattendichte des Tokyovirus-Kapsids entlang der Trisymmetron-Schnittstelle, die die innerste Schicht des mCP-Netzwerks zeigt. Pfeile zeigen schwache Dichten an, die den Scheitelpunkt des Kapsids und die innere Membranextrusion verbinden. (B) Isoflächenansicht der mCP-Komponenten, gefärbt wie in Abb. 4 (GlC; grün, ZpC; pink, ScPC; gelb, SuC; Königsblau) und mit durch Pfeile angegebenen Abständen von der inneren Membran zu den Komponenten. (C) Die innere Membran des Tokyovirus mit überlagertem ScPCs- (gelb) und SuC-Netzwerk (königsblau). (D) Fokussierung auf das Pentasymmetron auf der fünfzähligen Achse, die Abstände von der inneren Membranextrusion zu PC-α, β, γ (lila, hellgrün und cyan) und dem Penton (rotviolett) darstellt. Die Isofläche ist bei 2 σ dargestellt.

Das ScPC befindet sich weiter innerhalb der mCP-Schicht (gelb in Abb. 4, 5) und bildet ein Gerüst, das die innere Membran umgibt. ScPC hat eine große Kopf- und lange Schwanzstruktur, die entlang der Kante des Trisymmetrons angeordnet ist (Abb. 4 und 5B, C). Zwei ScPCs sind antiparallel mit Kopf und Schwanz verbunden, und beide Köpfe befinden sich an der Spitze des Fünfecks des Pentasymmetrons und umgeben die Membranextrusion (Abb. 5C). Die benachbarten ScPC-Anschlusspaare sind durch SuC (Königsblau in Abb. 5C) verbunden.

Die Pentondichte (zentraler Bereich in Abb. S2A) ähnelt der von PBCV-1 (Abb. S2B), da sie einen „Kappe“-Bereich aufweist, der an der MCP-Schicht ausgerichtet ist, und einen unteren Bereich, der an der mCP-Schicht ausgerichtet ist . Im Vergleich dazu fehlt ASFV dieser untere Bereich (Abb. S2C). Wir haben das PDB-Modell des PBCV-1-Pentons (Abb. S2E) an den oberen Bereich des Tokyovirus-Pentons (Abb. S2D) angepasst und gezeigt, dass das Tokyovirus-Penton ein ähnliches Volumen und eine ähnliche Struktur wie das PBCV-1-Penton aufweist, obwohl es homolog ist Das Protein des PBCV-1-Pentons wurde im Tokyovirus nicht identifiziert. Bei ASFV liegt die Insertionsdomäne außerhalb der MCP-Schnittstelle (Klammer in Abb. S2F), während weder Tokyovirus noch PBCV-1 eine klare Dichte für diese Domäne aufweisen. Diese Einfügungsdomäne erscheint in ASFV. Möglicherweise unterstützt es die Einfügung der DNA in das Kapsid, da ASFV auch eine äußere Membran durchdringen muss16. Diese Domäne ist auch im Cafeteriavirus-abhängigen Mavirus vorhanden (ein Virus, der ein bestimmtes NCLDV infiziert)51. Die Pentondichte einschließlich des unteren Bereichs selbst hat einen Abstand zur inneren Membranextrusion von ~ 150 Å (Abb. 5D). Die Lücke wurde mit drei Pentasymmetronkomponenten (PC-α, β und γ) und Materialien geringerer Dichte (Pfeil in Abb. 3C) unterstützt.

Die drei Pentasymmetron-Komponenten von PC-α, β und γ halten einen ähnlichen Abstand von der inneren Membranextrusion (54–60 Å) (Abb. 5D), der auch dem des ScPC-Arrays entlang der Trisymmetron-Grenzfläche ähnelt (42). Å) (gelb in Abb. 5B). PC-α (lila in Abb. 4B und 5D) ist das größte und interagiert miteinander und mit dem Penton selbst (Abb. 4B und 5D). Paare von PC-β und PC-γ (hellgrün und cyan in Abb. 4B und 5D) umgeben diese Gruppe von PC-α. PC-β interagiert hauptsächlich mit einem einzelnen PC-α und fungiert gleichzeitig als Terminal für das GlC (Abb. 4B). PC-γ interagiert mit zwei benachbarten Kopien von PC-α. Diese Proteinkomponenten dienen der Unterstützung des MCP-Arrays im Pentasymmetron. Sie halten auch Kontakt mit dem mCP-Netzwerk unter dem Trisymmetron und interagieren mit der Extrusion der inneren Membran über schlecht aufgelöste Materialien niedriger Dichte unter den fünfzähligen Scheitelpunkten.

Von Melbournevirus, einem der Marseilleviridae, wurde erstmals berichtet, dass es eine sehr charakteristische Extrusion der inneren Membran an den fünfzähligen Achsen aufweist28. Das Tokyovirus zeigt auch diese Extrusion der inneren Membran und ermöglichte darüber hinaus die Identifizierung mehrerer Schichten in der Extrusion (Sternchen in Abb. 3C und 5A, B, D). Interessanterweise umgeben die großen Köpfe des ScPC die Membranextrusion zusammen mit SuCs (Abb. 5C). Das ScPC-Array und die SuCs könnten eine Rolle bei der Verformung der Membran in diese extrudierte Form an den fünfzähligen Achsen spielen.

Eine BLAST-Suche52 wurde unter Verwendung der vorgeschlagenen MCP-Sequenz aus dem Entwurfsgenom des Tokyovirus29 durchgeführt (Tabelle 2). Das MCP des Tokyovirus zeigt die höchsten Werte gegen Iridovirus (PDBID: 6OJN)14 und PBCV-1 (PDBID: 5TIP)53, mit hoher Abdeckung und mäßiger Homologie, obwohl beide Vergleiche konservierter Sequenzen unter den „Identitäten“ liegen, die eine direkte Zuordnung ermöglichen und sichere Vergleiche54. Die drei jeweiligen MCP-Aminosäuresequenzen wurden von PROMALS3D55 ausgerichtet. Die Sekundärstruktur des Tokyovirus-MCP wurde unabhängig von PSIPRED56 vorhergesagt, das zwei Sätze von acht β-Strängen (B1 bis I2 in Abb. S3) identifizierte, die ein (doppeltes) Jelly-Roll-Motiv wie das MCP anderer NCLDVs7 bilden.

In der MCP-Aminosäuresequenz jedes Virus gibt es einen großen Unterschied in der Schleifenlänge zwischen den β-Strängen (Abb. S4). Um zu untersuchen, wie sich der Unterschied in der Schleifenlänge auf den Unterschied in der MCP-Struktur auswirkt, wurde ein Homologiemodell des Tokyovirus-MCP basierend auf dem MCP-Modell von PBCV-1 unter Verwendung des SWISSMODEL-Servers erstellt57. Das MCP-Trimer aus einer dreizähligen Achse der Kryo-EM-Karte des Tokiovirus wurde extrahiert (Abb. 6A). Anschließend wurde das Homologiemodell mithilfe von COOT58 manuell optimiert, um es an die MCP-Dichte anzupassen, und mit PHENIX59 energetisch minimiert, um sicherzustellen, dass die Struktur gültig ist (Abb. 6B). Das resultierende Homologiemodell wurde mit beiden MCP-Modellen von PBCV-1 und Iridovirus verglichen (Abb. S4). Beim Tokyovirus MCP sind die Schleifen, die die äußeren Teile von Jelly Roll 1 (JR1) oder JR2 verbinden, länger als die von PBCV-1. Die DE1- und FG1-Schleifen sind länger als die von PBCV-1 und von ähnlicher Länge wie die des Iridovirus. Die HI1-Schleife ist besonders ausgedehnt (Abb. S3 und S4), wobei die 23 Reste umfassende Sequenz des Tokyovirus länger ist als die von PBCV-1. Umgekehrt ist die DE2-Schleife im Tokyovirus im Vergleich zu denen von PBCV-1 und Iridovirus verkürzt. Andere Schleifen haben eine vergleichbare Länge. Diese Schleifen, die den externen Teil des MCP-Modells bilden, stimmen mit dem externen Teil der Dichte des Tokyovirus-MCP-Trimers überein, füllen jedoch nicht die gesamte Kappendichte des Tokyovirus-MCP-Trimers aus (Abb. 6B). Die Dichte im Tokyovirus-MCP, die durch das angepasste Homologiemodell nicht gefüllt wird, wurde rot hervorgehoben (Abb. 6C).

Kryo-EM-Karte und angepasstes Homologiemodell des Tokyovirus-MCP-Trimers. Das Homologiemodell wurde mit SWISS-MODEL57 generiert und mit COOT58 an das Volumen angepasst und mit PHENIX59 verfeinert. (A) Seiten- und Draufsichten der extrahierten Kryo-EM-Karte des MCP-Trimers. (B) Seiten- und Draufsichten der extrahierten MCP-Trimer-Kryo-EM-Karte mit angepasstem Homologiemodell. (C) Seiten- und Draufsicht der extrahierten MCP-Kryo-EM-Karte des MCP-Trimers mit der zusätzlichen rot gefärbten Kappenregion. Der Maßstabsbalken entspricht 2 nm. Die Isofläche des extrahierten MCP-Segments wird bei 2 σ angezeigt.

Die MCP-Dichte hat eine sichtbare Obergrenze (rot in Abb. 6C), die keinem Teil des angepassten Homologiemodells entspricht. Um dies zu überprüfen, haben wir drei MCPs aus verschiedenen Bereichen des Kapsids extrahiert – eines aus der dreizähligen Achse selbst, eines aus zwei MCP-Trimeren entfernt von der dreizähligen Achse und eines von einem Zwischenpunkt zwischen der zwei-, drei- und fünfzähligen Achse. Die direkte Kreuzkorrelation zwischen diesen lag bei der Berechnung in UCSF Chimera60 zwischen 0,99 und 0,91. Alle MCP-Trimere besitzen diese Kappendichte. Ein früherer Bericht28 für Marseilleviren zeigte, dass ein kleines Protein, das durch Proteomanalyse angezeigt wurde, in etwa den gleichen Mengen wie das MCP-Protein vorhanden war. Aufgrund der Natur von SPA (der Mittelung vieler Teilchen) und der Auferlegung der ikosaedrischen Symmetrie ist es jedoch möglich, dass nicht alle MCPs vollständig besetzt sind. Die Korrelation der Kappendichte reicht von 0,98 (die dreifache Kappendichte gegenüber der symmetrischen dreifachen Kappendichte) bis 0,87 bzw. 0,84 für die anderen beiden MCP-Positionen. Diese geringere Korrelation für die Kappendichte kann durch eine höhere Flexibilität verursacht werden, was wahrscheinlich ist, wenn das Protein stark glykosyliert ist. Die symmetrische Natur dieser Kappe deutet eher auf das Vorhandensein von Protein als auf eine ungeordnete posttranslationale Glykosylierung des MCP hin. Dies wird weiter durch die Periodic Acid Schiff (PAS)-Färbung61 von SDS-PAGE-getrennten Tokyovirus-Proteinen gestützt, die keine glykosylierten Proteine beim Molekulargewicht des MCP zeigen. Bei ~ 14 kDa ist jedoch eine Bande erkennbar (Abb. S5), was darauf hindeutet, dass die Kappendichte wahrscheinlich ein Protein enthält, das glykosyliert wurde und mit der Oberseite des MCP interagiert.

Hier haben wir 1 MV Kryo-HVEM auf die Strukturanalyse des Tokyovirus als vollständiges Viruspartikel angewendet und dabei einige der Auflösungsgrenzen überwunden, die durch den Effekt der Tiefenschärfe bei außergewöhnlich großen Partikeln entstehen. Die 3D-Rekonstruktion zeigte die höchste Auflösung eines Riesenvirus mit einer Größe von mehr als 200 nm, ohne dass die blockbasierte Rekonstruktionstechnik38 oder ähnliche Methoden16 zum Einsatz kamen. Allerdings hat die aktuelle Auflösung von 7,7 Å des Tokyovirus nicht das theoretische Maximum von 4,0 Å für ~250-nm-Partikel erreicht (rote Kurve in Abb. 1). In der Praxis beeinflussen viele Faktoren die Fähigkeit, eine bestimmte Auflösung über die Beschleunigungsspannung hinaus zu erreichen. Daher wurde vor der Untersuchung der biologischen Probe die Leistung des Mikroskopsystems mit Thon-Ringen eines Pt-Ir-Standardfilms bestätigt, der über 2 Å hinausragt (Abb. 2). Dies zeigt, dass das Mikroskop oder die Elektronenquelle keinen begrenzenden Faktor für die mit den Riesenviruspartikeln erzielten Auflösungen darstellt, auch wenn es keine Feldemissionselektronenquelle gibt und eine weniger kohärente LaB6-Quelle verwendet.

Obwohl es viele Faktoren gab, die die Auflösung des Tokyovirus auf 7,7 Å begrenzten, ist der Hauptbeschränkungsfaktor für die aktuelle Auflösung wahrscheinlich die Menge der Daten, die gesammelt werden können. Cryo-HVEM erfordert die manuelle Sammlung mikroskopischer Aufnahmen. Die insgesamt verwendeten 1182 Partikel aus 160 mikroskopischen Aufnahmen waren eine extrem kleine Zahl im Vergleich zu anderen gemeldeten SPA von Riesenviren unter Verwendung von 300-kV-Mikroskopen. PBCV-1 mit einem maximalen Durchmesser von 190 nm wurde mit ~ 13.000 Partikeln aus 5624 Bildern bei einer Rekonstruktion von 4,4 Å rekonstruiert15 und ASFV mit einem maximalen Durchmesser von 250 nm des äußeren Kapsids wurde mit 16.266 Partikeln aus 17.135 mikroskopischen Aufnahmen bei einer Rekonstruktion von 14,1 Å rekonstruiert62 und mit 63.348 Partikel aus 64.852 mikroskopischen Aufnahmen bei 8,8 Å Rekonstruktion16. Die Größe des Virus setzt Grenzen, die ein sorgfältiges Gleichgewicht zwischen einer geringeren Vergrößerung, um die Anzahl der pro Mikroaufnahme abgebildeten Partikel zu erhöhen, und einer ausreichend hohen Vergrößerung erfordern, um bei Rekonstruktionen sinnvolle Auflösungen zu erzielen. Das Tokyovirus mit einem maximalen Durchmesser von 250 nm ist so groß, dass selbst bei relativ geringer Vergrößerung bestenfalls etwa 12 Viruspartikel pro Aufnahme vorhanden waren (häufig ~ 6 Viruspartikel, z. B. in Abb. S6A), die für die 2D-Klassifizierung verwendet werden können. In diesem Fall wurde der „Super Resolution“-Modus (7420 × 6780 Detektorabmessungen) in der K2 Summit-Kamera zur Datenerfassung verwendet, wobei der Pixelabstand weniger als 1,5 Å/Pixel betrug (Tabelle 1). Die automatisierte Erfassung von mikroskopischen Aufnahmen, die in der Mainstream-Kryo-EM mittlerweile nahezu allgegenwärtig ist, würde die Datenmenge, die in einem bestimmten Zeitrahmen erfasst werden kann, erheblich erhöhen. Wir haben jedoch den „Super Resolution“-Modus für manuell betriebenes Kryo-HVEM gewählt, um eine bessere Partikelzahl (pro Mikroaufnahme) bei gleichzeitig höherer Abtastfrequenz aufrechtzuerhalten, obwohl die Detektorleistung leicht leidet (Abb. S1). Dies führt wahrscheinlich zu einer weiteren Einschränkung der erreichbaren Auflösung in diesem Experiment.

Eine weitere Einschränkung der erreichbaren Auflösung liegt in der Software. Einige Elemente der allgemeinen Kryo-EM-SPA-Bildverarbeitung unterstützen keine HVEM-Beschleunigungsspannungen. Gctf63 wurde nicht verwendet, da es keine 1-MV-Daten unterstützt. Ebenso wird die Dosisgewichtung von 1-MV-Daten sowohl in MotionCor264 als auch in der RELION-Implementierung65 nicht unterstützt, da es derzeit keine Parameter für Strahlenschäden bei 1 MV gibt. Glücklicherweise unterstützt CTFFIND66 1 MV-Daten für die Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF), daher haben wir sie in dieser Studie verwendet. Wir konnten keine Dosisgewichtung verwenden, obwohl dies durch höhere Beschleunigungsspannungen etwas ausgeglichen wird, was den Radikalschaden reduziert67. Das Partikelpolieren in RELION65 bietet ebenfalls nur geringe Vorteile, was möglicherweise an der Größe der Viren auf dem Mikrobild liegt, wo Verzerrungen über das Mikrobild möglicherweise zu Variationen der Virusverformung pro Bild führen. Die Ewald-Kugelkorrektur ganzer Partikel, die kürzlich in der RELION-Software-Suite65 implementiert wurde, hat auch gezeigt, dass sie Rekonstruktionen von 300-kV-Mikroskopen über einen Bereich von Durchmessern hinweg verbessert. Wir haben die Ewald-Kugelkorrektur für unsere Tokiovirus-Rekonstruktion getestet, die mit dem 1-MV-Kryo-HVEM durchgeführt wurde, und keine Verbesserung festgestellt. Dies kann daran liegen, dass die 7,7 Å-Rekonstruktion des Tokyovirus nicht hoch genug ist, um davon zu profitieren. Die oben erwähnte Softwareunterstützung, insbesondere die Dosisgewichtung, wird in Zukunft für die hochauflösende SPA von Riesenviren unter Verwendung von 1-MV-Mikroskopen benötigt.

Letztendlich bietet der Einsatz von Kryo-HVEM Vorteile für größere Partikel. Der verringerte Defokusgradient über einem Partikel hinweg unterstützt die hochauflösende Rekonstruktion des gesamten Partikels. Auch die Probenschädigung durch den Elektronenstrahl wird verringert, was besonders bei biologischen Proben wichtig ist. Darüber hinaus ermöglicht eine erhöhte Strahldurchdringung eine verbesserte Visualisierung der inneren Struktur, wie sie in der Kryo-Elektronentomographie mit Pithovirus, einem amphorenförmigen Riesenvirus mit einer Dicke von ca. 800 nm, verwendet wird8. Über die weiter verbreitete 300-kV-Kryo-EM hinaus ermöglicht es die Untersuchung feinerer Details noch größerer Viren, in die niedrigere Beschleunigungsspannungen nicht eindringen können. Schließlich ist die Rekonstruktionsmethode einfacher als die der blockbasierten Rekonstruktion. Die blockbasierte Rekonstruktion ist eine leistungsstarke Technik, aber wie der Name schon sagt, zerlegt sie die gesamte Struktur in Blöcke. Das Zusammenfügen dieser Karten wird als zusammengesetzte Karte bezeichnet. Diese Karten erfreuen sich zwar immer größerer Beliebtheit, bergen jedoch auch einige Gefahren. Beispielsweise können FSC-Berechnungen nicht ohne Artefakte auf zusammengesetzten Karten durchgeführt werden, und durch die Schärfung können Überlappungsartefakte zwischen Karten aufgedeckt werden. Wir haben die blockbasierte Rekonstruktion anhand von Datensätzen aus Kryo-HVEM getestet, die erzielte Auflösung konnte dadurch jedoch nicht verbessert werden. Obwohl die genauen Gründe unbekannt sind, lautet unsere Arbeitshypothese, dass die relativ geringe Anzahl von Partikeln in der endgültigen Rekonstruktion und die geringere Krümmung der Ewald-Kugel bei 1 MV (im Vergleich zu 300 kV) die Wirksamkeit der blockbasierten Rekonstruktion verringern. Blockbasierte Rekonstruktionsmethoden können jedoch bei ausreichender Partikelanzahl einige Vorteile in der Kryo-HVEM haben. Dies liegt daran, dass geringfügige Verzerrungen sehr großer symmetrischer Partikel überwunden werden können, was zu verbesserten Auflösungen führt. Für Objekte mit geringer Symmetrie ist weiterhin die direkte Methode mit höher beschleunigenden Elektronen erforderlich.

Die 7,7 Å große Kapsidstruktur des Tokyovirus stellt ein neues Kapsidnetzwerk von NCLDV dar. Die trapezförmigen LtC-Anordnungen im Tokyovirus bilden keine einzige Unterschicht unter dem MCP, wie die mCPs von PBCV-115 oder ASFV16, sondern basieren auf einem anderen CmC, der die drei gedrehten Trapeze innerhalb des Trisymmetrons verbindet (Abb. 5, S7). An den Trisymmetron-Grenzflächen sind zwei Proteinkomponenten von GlC und ZpC vorhanden und nicht ein einzelnes Protein (P11) wie in PBCV-1. SuC interagiert auch mit jedem Trapezgitter auf der Innenoberfläche und bildet darüber hinaus eine Verbindung mit ScPCs, die in den Rekonstruktionen von PBCV-1 und ASFV nicht vorhanden zu sein scheint.

Das Kapsid T = 309 (h = 7, k = 13) ist in der 3D-Rekonstruktion deutlich sichtbar (Abb. 3). Mit dieser Struktur können wir neu ein intermediäres „Scaffold“-Proteinkomponenten-Array (ScPC) zwischen dem Kapsid und der inneren Membran identifizieren (gelb in Abb. 4 und 5). Antiparallele ScPC-Paare laufen entlang der Trisymmetron-Schnittstelle und verbinden sich über die Pentasymmetron-Komponenten mit jedem Pentasymmetron. Diese Merkmale sind ziemlich analog zu den „Maßband“-Proteinen40, die in PBCV-1- und ASFV-Kryo-EM-Karten15,16 berichtet werden, bei denen es sich um das lange filamentöse mCP namens P2 in PBCV-1 und M1249L in ASFV handelt. Dies deutet darauf hin, dass die Kapsidkonstruktion des Tokyovirus möglicherweise über einen anderen Mechanismus erfolgt. Das Vorhandensein dieses Gerüstnetzwerks kann darauf hindeuten, dass das Gerüst für die Begrenzung der Kapsidabmessungen verantwortlich ist. Eine größere Klarheit dieser flexiblen ScPCs wird erforderlich sein, um ihre Wechselwirkungen detaillierter zu erläutern und möglicherweise mehr Licht auf ihre potenzielle Rolle im Bauwesen zu werfen.

Um das MCP-Homologiemodell zu erstellen, extrahierten wir das zentrale MCP-Trimer aus einem Trisymmetron und das Homologiemodell wurde an die Dichte eines starren Körpers angepasst. Bereiche des Homologiemodells, die schlecht zur Dichte passen, wurden manuell mit COOT58 korrigiert und mit der PHENIX59-Software energetisch verfeinert (Abb. 6B). Auf jeder MCP-Trimerdichte war ein leerer „Cap“-Bereich vorhanden, als das MCP-Homologiemodell daran angepasst wurde, obwohl wir diesen Bereich bisher nicht ausreichend für die Modellanpassung klären konnten. Daher waren wir uns zunächst nicht sicher, ob diese Dichte durch andere kleinere Proteine verursacht wird, die mit dem MCP interagieren, oder durch eine posttranslationale Modifikation des MCP. Wir haben einen Kandidaten für das Small-Cap-Protein identifiziert, da die Periodic-Säure-Schiff-Färbung (PAS)61 bei der SDS-PAGE gereinigter Tokyovirus-Partikel verwendet wurde, um potenzielle Glykoproteine zu identifizieren. Dies zeigte ein Protein mit ~ 14 kDa (Abb. S5B). Allerdings ist die Bande im Vergleich zu der von MCP im Coomassie-gefärbten Gel schwach (Abb. S5A). Die Kappendichte ist möglicherweise nicht für alle MCP-Trimere vorhanden, die sogenannte „Teilbelegung“ und die ikosaedrische Mittelung wirken sich daher auf deren Klarheit aus. Im Fall von PBCV-1 sind Zuckerketten direkt an MCP53 gebunden, während es im Fall von ASFV eine zweite Membran außerhalb des Kapsids selbst gibt16, sodass eine zusätzliche Glykosylierung des Kapsids weniger wichtig ist. Wir haben zuvor herausgefunden, dass einige Arten der Familie Marseilleviridae eine Bündelbildung in der Wirtsamöbe induzieren20. Gleichzeitig hafteten die neu übertragenen Viren an der Wirtszelloberfläche und richteten sich dabei aus. Ein Mitglied der Mimiviridae, das Tupanvirus, weist ebenfalls auf einen ähnlichen Mechanismus hin, bei dem ein Mannose-bindendes Protein (MBP), das auf der Zellmembran der Amöbe exprimiert wird, vermutlich an interzellulären Adhäsionen beteiligt ist68. Bei Marseilleviren wurde berichtet, dass 10 der 49 identifizierten Virionproteine glykosyliert waren18. Das Glykoprotein könnte bei der Bildung dieser Bündel und der Adhäsion an die Zelle eine Rolle spielen und möglicherweise die Übertragungsgeschwindigkeit erhöhen, es bedarf jedoch weiterer Untersuchungen, um die genaue Funktion zu klären.

Die Pentons von Tokyovirus und PBCV-1 weisen eine ähnliche Tiefe auf (Abb. S2A, B). Da die Dichte des Tokyovirus-Pentons an die des aus Kryo-EM abgeleiteten PDB-Modells von PBCV-1 (PDBID: 6NCL) angepasst wird (Abb. S2D), können wir eine Dichte für das Penton-Basisprotein und eine nicht modellierte Ebene der unteren Region finden mit der mCP-Schicht. Das Gleiche ist bei PBCV-1 zu erkennen (Abb. S2E). Das ASFV-Penton-Protein (Abb. S2F) passt in der gleichen Position und Ausrichtung wie das PBCV-1-Penton auf die einzelne Biskuitrolle, mit der Insertionsdomäne auf der Außenseite des Kapsids in einer Dichte, die weder PBCV-1 noch Tokyovirus besitzen klare dichte. Eine BLAST-Suche des Tokyovirus-Genoms unter Verwendung sowohl des PBCV-1-Pentons als auch des Cafeteriavirus-abhängigen Mavirus-Pentons, das in die ASFV-Pentonstruktur modelliert wurde, ergab keine Übereinstimmungen, sodass eine Identifizierung und Homologiemodellierung des Pentonproteins nicht möglich war . Angesichts der niedrigen BLAST-Werte für das Tokyovirus-MCP sowohl gegen PBCV-1 als auch gegen Mavirus (Tabelle 2) ist dies nicht unbedingt überraschend. Um die Natur des Proteins zu klären, das den unteren Bereich des Pentons einnimmt, müssen wir eine Rekonstruktion mit höherer Auflösung erreichen.

Unmittelbar um dieses kleine Pentamer herum befindet sich eine symmetrische Anordnung weiterer Proteinkomponenten von PC-α, β und γ innerhalb der mCP-Schicht, die die MCP-Anordnung im Pentasymmetron als Ersatz für die Gitterproteine unterstützen und mit der inneren Membranextrusion interagieren über Materialien mit geringer Dichte (Pfeile in Abb. 3C und 5A). Sie ähneln möglicherweise in etwa den „Laternen“-Proteinen in ASFV16. Diese erstrecken sich weiter bis zum Rand des Pentasymmetrons und interagieren mit dem ScPC-Array (Abb. 4B). Dies ist eine neuartige Struktur in NCLDV und spielt wahrscheinlich eine Rolle bei der Bildung der inneren Membranextrusion.

Zusammenfassend haben wir basierend auf der theoretischen Auflösungsschätzung 1 MV Kryo-HVEM für die Einzelpartikelanalyse des Tokyovirus angewendet, bei dem es sich um ein großes Viruspartikel mit einem maximalen Durchmesser von 250 nm handelt. Dies enthüllte die 7,7 Å große Kapsidstruktur mit einer begrenzten Datenmenge ohne Verwendung einer blockbasierten Rekonstruktionstechnik. Die Kryo-EM-Karte zeigte das neuartige Kapsidnetzwerk, das die charakteristischen inneren Membranextrusionen unter den ikosaedrischen Spitzen ermöglicht. Das fortschrittliche ScPC-Array stellt ein Gerüst dar, das die extrudierte Struktur der inneren Membran unterstützt und möglicherweise auch als Maßbandprotein fungiert, über das in anderen NCLDVs berichtet wird. Die einzigartigen PC-α, β und γ unterstützen wahrscheinlich auch die Membranextrusionen. Obwohl es hinsichtlich der MCP-Struktur viele Ähnlichkeiten mit den Strukturen von PBCV-1 und ASFV aufweist, fanden wir eine Kappendichte auf dem MCP, von der angenommen wurde, dass sie ein Glykoprotein enthält. Das in Marseilleviridae identifizierte Glykoprotein interagiert möglicherweise mit der Oberfläche der Wirtszelle. Dies wiederum kann bei einigen Arten zur Bündelbildung von Wirtszellen führen, wie bereits gezeigt wurde20. Das an der Universität Osaka installierte 1-MV-Kryo-HVEM verfügte über ausreichende Leistung, um die theoretische Auflösung zu erreichen, die aktuelle Auflösung des Tokyovirus-Kapsids war jedoch auf 7,7 Å begrenzt. Eines der größten Probleme war die begrenzte Datenmenge. Dies wird in Zukunft durch die Installation einer automatisierten Datenerfassungssoftware gelöst. Auch die Verwendung eines größeren Detektorformats oder die Verbesserung der Superauflösungsleistung des Gatan K2-Detektors in Kombination mit HVEM kann das Problem beheben, da der erhebliche Abfall des Niederfrequenzsignals im Superauflösungsmodus bei 1 MV eine Einschränkung der Superauflösungsschätzung darstellen kann Algorithmus für Elektronen höherer Energie im aktuellen K2-Detektor (Abb. S1). Ein weiteres großes Problem ist die begrenzte Unterstützung der Software für 1-MV-Aufnahmen. Wenn aktuelle fortschrittliche Techniken wie Dosisgewichtung während der Bewegungskorrektur und Bayes'sches Partikelpolieren verwendet werden können und eine vollständige Verfeinerung der CTF-Parameter optimiert werden kann, sollte die Kombination aller dieser Techniken es ermöglichen, dass sich die Auflösung dem theoretischen Wert annähert. Weitere Optimierungen und detaillierte analytische Auswertungen zur Lösung der in dieser Studie identifizierten Probleme werden für die Verwendung von Kryo-HVEM unter Verwendung einer LaB6-Elektronenquelle zur Strukturanalyse großer biologischer Proben erforderlich sein. Um die Auflösungsbeschränkungen von Kryo-HVEM zu erkennen, sollten wir SPA auch mit gut getesteten Proben wie Apoferritin, TMV und/oder GroEL testen. Darüber hinaus würden sorgfältige Vergleiche mit herkömmlichen 300-kV-Kryo-EM dazu beitragen, das Potenzial von Kryo-HVEM in der Zukunft aufzuzeigen.

Tokyovirus29 wurde ursprünglich von Professor Masaharu Takemura von der Tokyo University of Science bereitgestellt. Es wurde in Acanthamoeba castellanii-Zellen vermehrt, die in PYG-Medium (2 % w/v Proteosepepton, 0,1 % w/v Hefeextrakt, 4 mM MgSO4, 0,4 mM CaCl2, 0,05 mM Fe(NH4)2(SO4)2, 2,5 mM) kultiviert wurden Na2HPO4, 2,5 mM KH2PO4, 100 mM Saccharose, pH 6,5). Die Viren wurden wie zuvor beschrieben gereinigt27,28. Zusammenfassend wurde die infizierte Kulturflüssigkeit gesammelt und 10 Minuten lang bei 1500 g und 4 °C zentrifugiert, um abgestorbene Zellen zu entfernen, bevor der Überstand 35 Minuten lang bei 10.000 g und 4 °C zentrifugiert wurde. Das Pellet wurde in 1 ml PBS-Puffer suspendiert und auf einen 10–60 %igen Saccharosegradienten geladen, bevor es 90 Minuten lang bei 8000 g und 4 °C weiter zentrifugiert wurde. Die konzentrierte Bande wurde extrahiert und in PBS dialysiert, bevor eine weitere Zentrifugationsrunde unter den gleichen Bedingungen durchgeführt wurde. Das Pellet wurde in PBS suspendiert, bevor Kryo-EM-Gitter hergestellt wurden.

Eine Probe des gereinigten Tokyovirus wurde mit SDS-PAGE-Probenpuffer (2332330/AE-1430 EzApply, ATTO) behandelt und 5 Minuten lang gekocht. 10 μg jeder denaturierten Probe wurden in eine Vertiefung (2331635/CHR12.5L c, ATTO) geladen und 7 μl eines standardmäßigen molekularen Markers (2332340/AE-1440, ATTO) laufen gelassen, um die Molekulargewichte der resultierenden Proteinbanden abzuschätzen. Die Elektrophorese wurde bei einem konstanten Strom von 10,5 mA mit einem Elektrophoresepuffer (2332323/WSE-7055, ATTO) unter Verwendung eines Elektrophoresesystems (2322240/WSE-1010, ATTO) durchgeführt. Das resultierende Gel wurde mit einem Regent (2332370/AE-1340, ATTO) gefärbt. Die Schiff-Färbung mit periodischer Säure wurde gemäß dem im PAS-Färbekit (GlycoGel Stain Kit 24693-1, PSI) beschriebenen Protokoll durchgeführt.

Zum Einsatz kam ein JEOL JEM-1000EES Kryo-HVEM (JEOL Inc.), das im Forschungszentrum für Ultra-HVEM der Universität Osaka installiert ist. Das Mikroskop war mit einer LaB6-Filamentelektronenkanone mit einer Beschleunigungsspannung von 1 MV, einer Autoloader-Stufe, die bis zu 12 gefroren-hydratisierte EM-Gitter unter kryogenen Bedingungen halten kann, und einer K2 IS-Direktdetektorkamera (Gatan Inc.) ausgestattet. Der Probentisch und die Probenlagerung wurden stets mit flüssigem Stickstoff gekühlt, der automatisch nachgefüllt wird. Bilddaten wurden manuell erfasst. Für den Test der Auflösungsgrenze des 1-MV-Kryo-HVEM wurde ein Pt-Ir-Film (JEOL Inc.) mit einer nominalen Vergrößerung von 100.000 × (0,22 Å/Pixel auf der Probe) und einer Defokussierung von 0,6–2 μm abgebildet. Filmbilder wurden mit einer K2 IS-Kamera im Zählmodus bei einer Dosisleistung von ∼ 8 e−/Pixel/s mit 0,2 s/Bild für 1 s Belichtung aufgezeichnet. Bewegungskorrigierte Vollbilder wurden mit der DigitalMicrograph-Software (Gatan Inc) summiert. Für den Bildqualitätstest wurden MTF- und DQE-Kurven mithilfe des Schattens einer Strahlstopper-Metallklinge sowohl im Zählmodus als auch im Superauflösungsmodus des Gatan K2 IS im Kryo-HVEM gemessen. Die Daten wurden mit FindDQE69 verarbeitet. Zum Vergleich wurden die Daten unter den gleichen Bedingungen mit einer 300 kV Titan Krios G2 (Thermo Fisher Scientific) und einer im Institut installierten K2 Summit-Kamera gesammelt.

Ein Aliquot (2,5 μl) der gereinigten Tokyovirus-Partikel wurde auf Quantifoil-Gitter vom Typ R 1,2/1,3 (Quantifoil Micro Tools) platziert, die unmittelbar zuvor mit einem Plasma-Ionenbombardierer (PIB-10, Vacuum Device Inc.) einer Glimmentladung unterzogen wurden. Dieses Gitter wurde dann geblottet (Blotzeit: 10 s, Blotkraft: 10) und unter Verwendung eines Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) bei einer Einstellung von 95 % Luftfeuchtigkeit und 4 °C tauchgefroren. Insgesamt 304 mikroskopische Aufnahmen wurden manuell mit einem JEOL JEM-1000EES (JEOL Inc.) aufgenommen, das mit einem Autoloader-Tisch und einer K2 Summit-Kamera (Gatan Inc.) ausgestattet ist und für 1 MV HVEM optimiert ist, in insgesamt sieben Sitzungen unter Verwendung von drei Rastern. Mikrofotografische Filmbilder wurden im Superauflösungsmodus mit einer Vergrößerung von 1,456 Å/Pixel und einer Zieldefokussierung von 2–4 μm aufgenommen. Jede Belichtung dauerte 32 Sekunden bei einem Bildintervall von 0,2 Sekunden, also insgesamt 160 Bilder pro Aufnahme. Die Rahmen wurden mit EMAN270 gestapelt.

Mikrofotografiefilme wurden in eine Betaversion von RELION 3.1 importiert, vor der Bewegungskorrektur mit der RELION-Implementierung65 von MotionCor264. Die Bewegungskorrektur wurde unter Verwendung von 5 × 5 Patches mit einer B-Faktor-Unschärfe von 500 Å2 durchgeführt. Die Schätzung der Kontrastübertragungsfunktion (CTF) der Bilder wurde mit CTFFIND 4.1.1066 mit den folgenden Parametern durchgeführt: untere Defokussierungsgrenze, 2500 Å; obere Defokussierungsgrenze: 80.000 Å; Schrittgröße: 100; erschöpfende Suche. Nach dem ersten Durchlauf mit einer Boxgröße von 512 wurden gute CTF-Anpassungen ausgewählt und fehlgeschlagene Anpassungen wurden mit einer größeren FFT-Boxgröße erneut durchgeführt. Dies wurde bis zu einer FFT-Boxgröße von 2.048 wiederholt. Andere Parameter wurden auf den Standardeinstellungen belassen. Nach diesem Zeitpunkt wurden Mikroaufnahmen, bei denen keine gute Übereinstimmung gefunden wurde, verworfen. Wir definieren eine „gute“ CTF-Anpassung als eine, die unterscheidbare Thon-Ringe aufweist und mit der das simulierte Leistungsspektrum übereinstimmt. Dies führte dazu, dass insgesamt 156 Schliffbilder übertragen wurden. 1529 Partikel wurden manuell ausgewählt, mit 4-fachem Downsampling auf 5,824 Å/Pixel extrahiert (2400 × 2400 Pixel-Boxen werden zu 600 × 600 Pixel-Boxen) und 2D in 40 Klassen mit einem kreisförmigen Maskendurchmesser von 2600 Å und einer Winkelabtastung von 2° klassifiziert ( (durch Nutzung der GPU-Beschleunigung automatisch auf 3,75° erhöht) und einem Suchbereich von 7 Pixeln. 1458 Partikel wurden in gute Klassen übertragen und ein zweites Mal mit 1°-Winkelabtastung (automatisch auf 1,825° erhöht) und aktivierter Option „CTF bis zum ersten Peak ignorieren“ zweidimensional klassifiziert, was zu 1419 Partikeln in guten Klassen führte. Die gesamte 3D-Verarbeitung wurde mit auferlegter Ikosaeder-Symmetrie durchgeführt. Ein erstes Modell wurde mit dem stochastischen Gradientenabstiegsalgorithmus in RELION 3.1 generiert. Diese Partikel wurden einer 3D-Klassifizierung in 5 Klassen unterzogen, wobei eine Winkelabtastung von 1,8° für 25 Iterationen verwendet wurde, gefolgt von einer Winkelabtastung von 0,5° für weitere 25 Iterationen. Es wurden die beiden besten Klassen mit insgesamt 1.297 Partikeln ausgewählt. Die 3D-Verfeinerung wurde ausschließlich mit einer sphärischen Maske durchgeführt. Die Partikel wurden mit 3-fachem Downsampling (4,368 Å/Pixel) erneut extrahiert und neu zentriert und weiter verfeinert, dann erneut extrahiert und mit 2-fachem Downsampling (2,912 Å/Pixel) neu zentriert. Zur Verbesserung der erreichten Auflösung wurden eine Vergrößerungsanisotropieverfeinerung und eine CTF-Verfeinerung durchgeführt. Die 3D-Klassifizierung in 5 Klassen mit deaktivierter Ausrichtung wurde unter Verwendung einer Maske durchgeführt, die das ungeordnete Innenvolumen (virale DNA) blockierte, und die beste Klasse mit 1182 Partikeln wurde ausgewählt. Die Partikelpolitur hatte bei der Anwendung einen vernachlässigbaren Effekt. Die endgültige Auflösung nach dem Prozess hängt stark von der verwendeten Maske ab: Eine reine Kapsidmaske führt zu einer geschätzten Auflösung von 7,7 Å, einschließlich der Gerüstproteine und der inneren Membran verringert sich diese auf 8,7 Å. Eine weiche sphärische Maske ergibt eine Auflösung von 9,4 Å. Die lokale Auflösung wurde mit dem Blocres-Modul von Bsoft71 ohne angewendete Maske berechnet. Der vollständige Weg durch die SPA-3D-Rekonstruktion ist in Abb. S6 zusammengefasst.

Das MCP-Protein des Tokyovirus wurde anhand des zuvor veröffentlichten Genoms identifiziert. Die primäre Aminosäuresequenz des Tokyovirus-MCP wurde von BLASTP72 mit denen anderer NCLDVs verglichen, und die Server SWISS-MODEL57 und I-TASSER73 wurden verwendet, um ein Homologiemodell unter Verwendung des MCP-Modells von PBCV-1 (PDBID: 5TIP)53 zu generieren eine Vorlage. Dieses Homologiemodell wurde in ein aus der dreizähligen Symmetrieachse extrahiertes Tokyovirus-MCP-Trimer mit starrem Körper eingepasst und Abschnitte des Modells, die außerhalb der Dichte lagen, wurden durch COOT58 angepasst und durch PHENIX59 energetisch verfeinert. Der Mittelpunkt des Trisymmetrons wurde visuell identifiziert und mit dem Volume Eraser-Tool in UCSF Chimera60 extrahiert, dann wurde das Volumen auf 1003 Pixel zugeschnitten. Das resultierende Modell wurde gespeichert. Die Trisymmetronkarte wurde mit dem SEGGER74-Modul von USCF Chimera segmentiert und Segmente, die das Modell überlappten, in einem separaten Volumen gespeichert. Für das Penton-Basisprotein wurde die PDB-Struktur des Pentons von PBCV-115 an die Mitte der fünfzähligen Achse angepasst und SEGGER zum Extrahieren der Region verwendet. Dadurch wurde auch die Mehrheit der angrenzenden fünf MCPs ausgewählt. Daher wurde Molmap in UCSF Chimera60 verwendet, um eine 15 Å-Molekülkarte zu erstellen, und die Karte wurde an das Modul relion_mask_create von RELION 3.1 übergeben, um eine binäre Maske mit einer Ausdehnung von 5 Pixeln und einer weichen Kante von 5 Pixeln zu generieren. Anschließend wurde die Maske auf den extrahierten Bereich gelegt.

Die 3D-Rekonstruktionen des Tokiovirus wurden je nach Dimensionalität mit dem Modul relion_display von RELION 3.150 oder UCSF Chimera60 visualisiert. Pt-Ir-Leistungsspektren wurden mit Fiji75 visualisiert und die Rotationsmittelwerte wurden mit dem Plugin Radial Profile Extended berechnet.

Die Kryo-HVEM-Rekonstruktionen wurden in die EMDB hochgeladen und sind unter den folgenden Zugangscodes verfügbar: 30797: Nachbearbeitungsmaske nur für Kapsid, 7,7 Å, 30798: Nachbearbeitungsmaske für Kapsid, Gerüst und interne Membran, 8,7 Å, 30799 ; Weiche sphärische Nachbearbeitungsmaske, 9,4 Å.

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Wir danken Masaharu Takemura für seine kritische Lektüre und seine wertvollen Vorschläge sowie Yoko Kayama für die erste Sammlung von Kryo-EM-Daten. Diese Arbeit wurde von MEXT KAKENHI (JP19H04845 an K.Mu.), dem Joint Research of ExCELLS (20-004, 22EXC601 an K.Mu.), dem Cooperative Study Program des National Institute for Physiological Sciences (20-239 an K.Mu.) unterstützt .Mu.), SOKENDAI (an AC), Vetenskapsrådet (VR)/The Swedish Research Council (2018-03387 an KO), die Swedish Foundation for International Cooperation in Research and Higher Education (STINT) (JA2014-5721 an Janos Hajdu und KO), FORMAS-Forschungsstipendium des Schwedischen Forschungsrats für Umwelt, Agrarwissenschaften und Raumplanung (2018-00421 an KO), der Königlich Schwedischen Akademie der Wissenschaften (BS2018-0053 an KO).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Akane Chihara und Raymond N. Burton-Smith.

Abteilung für Physiologische Wissenschaften, School of Life Science, The Graduate University for Advanced Studies (SOKENDAI), Okazaki, Aichi, Japan

Akane Chihara, Chihong Song und Kazuyoshi Murata

Exploratory Research Center on Life and Living Systems (ExCELLS), National Institutes of Natural Sciences, Okazaki, Aichi, Japan

Akane Chihara, Raymond N. Burton-Smith, Chihong Song und Kazuyoshi Murata

National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences, 38 Nishigonaka, Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8585, Japan

Akane Chihara, Raymond N. Burton-Smith, Chihong Song und Kazuyoshi Murata

Forschungszentrum für Ultrahochspannungs-Elektronenmikroskopie, Universität Osaka, Ibaraki, Osaka, Japan

Naoko Kajimura und Kaoru Mitsuoka

Programm für Molekulare Biophysik, Abteilung für Zell- und Molekularbiologie, Universität Uppsala, Uppsala, Schweden

Kenta Okamoto

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K.Mu. hat das Projekt konzipiert. KO stellte die Tokyovirus-Probe zur Verfügung. CS und K.Mu. vorbereitete KryoEM-Proben. AC, RNBS, CS, NK, K.Mi. und K.Mu. gesammelte Kryo-EM-Daten. NK und K.Mi. stellte die HVEM-Leistungsdaten zur Verfügung. AC, RNBS, CS und K.Mu. verarbeitete die Kryo-EM-Daten. AC, RNBS, CS und K.Mu. bereitete Abbildungen vor und verfasste den Haupttext des Manuskripts. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Chihong Song oder Kazuyoshi Murata.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chihara, A., Burton-Smith, RN, Kajimura, N. et al. Ein neuartiges Kapsidproteinnetzwerk ermöglicht die charakteristische innere Membranstruktur von Marseilleviridae-Riesenviren. Sci Rep 12, 21428 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24651-2

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Eingegangen: 21. Mai 2022

Angenommen: 18. November 2022

Veröffentlicht: 11. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24651-2

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