Direkte Beobachtung der Konformationszustände von PIEZO1

Nature Band 620, Seiten 1117–1125 (2023)Diesen Artikel zitieren

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PIEZOs sind mechanosensitive Ionenkanäle, die Kraft in chemoelektrische Signale umwandeln1,2 und in verschiedenen physiologischen Situationen eine wesentliche Rolle spielen3. In-vitro-Studien haben gezeigt, dass PIEZO-Kanäle mechanische Kraft durch die Verformung ausgedehnter Klingen von Transmembrandomänen übertragen, die von einer zentralen ionenleitenden Pore ausgehen4,5,6,7,8. Allerdings ist wenig darüber bekannt, wie diese Kanäle mit ihrer natürlichen Umgebung interagieren und welche molekularen Bewegungen der Aktivierung zugrunde liegen. Hier beobachten wir direkt die Konformationsdynamik der Klingen einzelner PIEZO1-Moleküle in einer Zelle mithilfe nanoskopischer Fluoreszenzbildgebung. Im Vergleich zu früheren Strukturmodellen von PIEZO1 zeigen wir, dass die Schaufeln im Ruhezustand durch die von der Plasmamembran ausgeübte Biegespannung deutlich ausgedehnt werden. Der Grad der Ausdehnung variiert dramatisch über die Länge der Klinge, wobei eine verringerte Bindungsstärke zwischen Subdomänen eine erhöhte Flexibilität der distalen Klinge erklären kann. Mithilfe chemischer und mechanischer Modulatoren von PIEZO1 zeigen wir, dass die Klingenausdehnung und die Kanalaktivierung korrelieren. Unsere Erkenntnisse beginnen aufzudecken, wie PIEZO1 in einer nativen Umgebung aktiviert wird. Allgemeiner ausgedrückt: Da wir Konformationsverschiebungen von einzelnen Nanometern aus Kanalpopulationen zuverlässig erkennen können, gehen wir davon aus, dass dieser Ansatz als Rahmen für die Strukturanalyse von Membranproteinen durch nanoskopische Bildgebung dienen wird.

Die Fähigkeit, mechanische Informationen aus der Umgebung zu erfassen und weiterzuleiten, ist für eine Vielzahl physiologischer Prozesse in allen Lebensbereichen von entscheidender Bedeutung9. Mechanotransduktionskanäle nutzen mechanische Arbeit, um als Reaktion auf Störungen in der Zellmembran direkt eine ionenleitende Pore zu öffnen und so zelluläre Signale auszulösen10. PIEZOs sind eine Familie von Mechanotransduktionskanälen, die in Eukarya1,2 vorkommen und eine Vielzahl physiologischer Prozesse bei Säugetieren vermitteln, darunter Berührungsempfindung11, Blutdruckkontrolle12, Gefäßentwicklung13,14, mechanischer Juckreiz15 und Erythrozytenhydratationszustand16.

PIEZOs sind große, homotrimere Membranproteine, die strukturell als Triskel angeordnet sind4,5,7 (Abb. 1a). Jedes Protomer berührt die zentralen Poren- und Kappendomänen in der Nähe des C-Terminus und projiziert eine Klinge aus 36 Transmembrandomänen, die sich sowohl nach außen als auch nach oben in Richtung des N-Terminus erstreckt. Obwohl nur partielle Kryo-Elektronenmikroskopie-Strukturen (Kryo-EM) von PIEZO1 verfügbar sind, denen etwa ein Drittel der distalen Flügel fehlen, wurde das Strukturhomolog PIEZO2 mit dem gesamten Komplement an Transmembrandomänen gelöst17. In Strukturmodellen und Vorhersagen bilden die Schaufeln eine Schüsselform mit einem Durchmesser von etwa 24 nm und einer Tiefe von 9 nm und einer projizierten Gesamtfläche von etwa 450 nm2. Die Klingen sind über einen intrazellulären Strahl direkt mit der Pore verbunden, was darauf hindeutet, dass es sich sowohl um Hebel handelt, die den Kanal direkt steuern, als auch um die primären Sensoren für mechanische Kraft6.

a, Strukturmodelle von PIEZO1, extrazellulär betrachtet. Dargestellt sind die vollständigste Kryo-EM-Struktur von PIEZO1 mit dem fehlenden distalen etwa ein Drittel der Klinge hervorgehoben (links) und die AlphaFold II-Strukturvorhersage von PIEZO1 (rechts). Die C-terminale extrazelluläre Domäne (CED) wurde aufgrund schlechter Vorhersage aus dem AlphaFold II-Modell entfernt. TCO*K-Tags an Position 103 werden als magentafarbene Sterne angezeigt. Jedes Protomer ist separat gefärbt. b, Segmentierung der möglichen PIEZO1-Partikel aus iPALM-Lokalisierungen. Ein repräsentatives ×100-Differenzial-Interferenzkontrastbild (aus n = 5 Zellen) einer HEK293-Zelle, die TCO*K 103 PIEZO1 exprimiert, markiert mit Tetrazin – Alexa Fluor 647 (AF647) (oben links; Maßstabsbalken, 10 µm). Eine 3-nm-pro-Pixel-Darstellung der Plasmamembran-Lokalisierungen aus dem magentafarbenen Einschub oben links (Maßstabsleiste, 3 µm) (oben Mitte). Binäre AF647-Lokalisierungen (magentafarbene Punkte) mit möglichen PIEZO1-Molekülen, die die Anforderungen für den nächsten Nachbarn erfüllen, hervorgehoben durch cyanfarbene Kästchen (Maßstabsbalken, 3 µm) (oben rechts). Es werden auch repräsentative 3-nm-pro-Pixel-Darstellungen von möglichen dreifach markierten PIEZO1-Molekülen angezeigt, die die Mindestanforderungen an die Interlokalisationstrennung erfüllen (Maßstabsbalken, 30 nm) (unten). c: Fusioniertes Superpartikel identifizierter trimerer PIEZO1-Lokalisationen mit dreifacher Symmetrieförderung, von oben nach unten betrachtet (n = 5 abgebildete Zellen, n = 726 Moleküle und n = 8.500 Lokalisationen). Lokalisierungen wurden mit Größe und Farbe proportional zur lokalen Dichte visualisiert (siehe Methoden). d, Superteilchen mit Schwellenwert für eine lokale Dichte von mehr als 0,5 × 10−5, dem Minimum, das Lokalisierungen innerhalb einer 60-nm-Kugel umfasst (links). Mit jedem Blade verbundene Lokalisierungen, isoliert mit k-Mittel-Clustering mit k = 3 Clustern (rechts). e, Streudiagramm der durchschnittlichen Interblade-Abstände pro Lokalisierung zwischen jeder Lokalisierung innerhalb eines Blade-Clusters vom Superteilchen in Teil c und allen Lokalisierungen in einem benachbarten Blade-Cluster, gefärbt nach lokaler Dichte. An Position 103 beträgt der wahrscheinlichste Abstand zwischen den Blättern 25,4 ± 5,9 nm (Mittelwert ± Standardabweichung), verglichen mit 19,2 nm, berechnet mit dem AlphaFold II-Modell.

Quelldaten

Bei der Rekonstitution in künstliche Lipiddoppelschichten ist die nichtplanare Form von PIEZO1 ausreichend steif, um die Membran um sich herum zu biegen und eine Kuppel zu bilden8,18. Allerdings ist diese Kuppel auch intrinsisch verformbar, eine Eigenschaft, die wahrscheinlich durch die Flexibilität der Schaufeln gesteuert wird. Beobachtungen der Membrankuppel in Lipidvesikeln und begleitende mathematische Modelle deuten darauf hin, dass sich PIEZO1 in einer planaren Lipiddoppelschicht ohne seitliche Spannung oder Druckkräfte im Vergleich zum durch Detergens solubilisierten Zustand abflachen sollte4,8,18,19. Eine solche Verformung wird durch den Energieaufwand zum Biegen der Membran verursacht, in der sich das gekrümmte PIEZO-Protein und die planare Lipiddoppelschicht in einem mechanischen Gleichgewichtszustand befinden. Von außen ausgeübte Kräfte scheinen die PIEZO-Kuppel weiter zu verformen und werden flacher, wenn mit einem Rasterkraftmikroskop auf eine unterstützte planare Lipiddoppelschicht geklopft wird8 und in einer Molekulardynamiksimulation der Doppelschichtausdehnung durch seitliche Spannung20. Eine partielle Kryo-EM-Struktur von PIEZO1, die von außen nach außen in einem 10-nm-Lipidvesikel gelöst wurde, zeigt auch eine Klingen- und Balkenverformung unter sehr hohen Biegekräften21. Zusammen stützen diese Daten das Modell, dass die Klingen ausreichend flexibel sind, um sich bei Membranverformung zu biegen und wahrscheinlich Kraft zum Öffnen der Pore zu übertragen. Aufgrund der Komplexität und Heterogenität der Zellmembranen mussten diese Experimente jedoch in hochreinen Systemen durchgeführt werden, und Methoden zur Kraftausübung auf den Kanal haben keine direkte physiologische Relevanz. Auch die umfangreiche Mittelung, die für die Zusammenstellung von Kryo-EM-Strukturmodellen erforderlich ist, versagt in vielen Fällen bei der Auflösung der potenziellen Breite von Konformationszuständen, insbesondere von relativ flexiblen Proteindomänen.

In dieser Studie überwinden wir diese bisherigen Einschränkungen, indem wir nanoskopische Fluoreszenzbildgebung verwenden, um die Konformationszustände der Klingen einzelner PIEZO1-Kanäle in einer Zellmembran direkt zu beobachten. Zwei hochauflösende nanoskopische Bildgebungsansätze in Kombination mit neuartigen Partikelidentifizierungs- und Segmentierungsalgorithmen ermöglichten es uns, einzelne PIEZO1-Moleküle mit Nanometerauflösung zu isolieren und zu messen. Mit diesem Ansatz haben wir Reize auf Zellen angewendet und untersucht, wie die Klingenexpansion mit der Kanalaktivierung und -hemmung korreliert. Durch diese Experimente beginnen wir auch, den grundlegenden Mechanismus der Kanalmodulation durch den niedermolekularen Aktivator Yoda1 und den Inhibitor GsMTx-4 aufzudecken. Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, wie die zelluläre Umgebung die Struktur von PIEZO1 formen kann und wie die Klingenausdehnung der Kanalaktivierung zugrunde liegt.

Protein-Tags und Affinitätssonden führen zu Fehlern in der hochauflösenden Fluoreszenzmikroskopie, da der Fluorophor (oder die Fluorophore) und die markierte Position physikalisch versetzt sind22. Um diese Art von räumlichem Fehler zu minimieren, haben wir jede Untereinheit von PIEZO1 mit einem einzelnen extrazellulären Fluorophor markiert, indem wir die Erweiterung des genetischen Codes und die Klick-Chemie nutzten. Ein orthogonales Aminoacyl-tRNA-Synthetase- und tRNA-Paar, das das Amber-Codon UAG23 erkennt, wurde verwendet, um ein an trans-Cycloocten (TCO*K) konjugiertes Lysin an Aminosäureposition 103 in Maus-PIEZO1 einzubauen, das heterolog in HEK293-Zellen exprimiert wird. Obwohl das letzte etwa ein Drittel der PIEZO1-Klinge nicht durch Kryo-EM4,5,7 aufgelöst wurde, wurde die Struktur dieser Region durch AlphaFold II24 und Homologiemodellierung unter Verwendung der PIEZO2-Struktur17 vorhergesagt (Abb. 1a und Extended Data Abb. 1a). Die Aminosäure 103 befindet sich in der distalsten extrazellulären Schleife von PIEZO1 relativ zur Pore, und diese Positionen sind in der Tertiärstruktur um 19,2 nm voneinander entfernt (Extended Data, Abb. 1b). Lebende Zellen, die TCO*K 103 PIEZO1 exprimierten, wurden mit dem komplementären Klicksubstrat Tetrazin markiert, das an Alexa Fluor 647 konjugiert war (Extended Data Abb. 2a,b). Es wurde bestätigt, dass diese Schleife extrazellulär ist (Extended Data Abb. 2b), und wir haben festgestellt, dass Tagging oder Click-Labeling die Kanalfunktion nicht beeinträchtigt (Extended Data Abb. 3a–e). Nach der Markierung wurden die Zellen in einer isosmotischen Vernetzungslösung fixiert, um Veränderungen in der Zellmorphologie zu verhindern, und ohne Permeabilisierung abgebildet, um die Plasmamembran intakt zu halten. Insgesamt führt unser Markierungssystem ein Fluorophor mit einem physikalischen Versatzfehler von weniger als 1 nm in die Aminosäurekette von PIEZO1 ein25 und fängt den Kanal in einer nativen zellulären Umgebung ein.

Um die Ruhekonformation von PIEZO1 in einer Zellmembran mit Strukturmodellen zu vergleichen, haben wir zunächst markierte Zellen mit 3D-interferometrischer Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (iPALM)26 abgebildet, einer Technik, die zuvor zur Messung von Konformationsänderungen in großen Mengen in Membranproteinen27 verwendet wurde. Einzelne dreifach markierte PIEZO1-Partikel, die auf der Plasmamembran lokalisiert waren, wurden mithilfe eines benutzerdefinierten Algorithmus identifiziert und segmentiert (Abb. 1b und erweiterte Daten Abb. 4). Hier wurden Cluster mit drei Lokalisierungsdichten aus Wahrscheinlichkeitsdichtedarstellungen identifiziert und als einzelne Partikel segmentiert (siehe Methoden). Da die effektiven Lokalisierungsfehler für jede Molekülposition in der Nähe des durch Strukturen vorhergesagten Abstands zwischen den Klingen liegen und durch zusätzliche Probendrift und Vibrationsfehler verschleiert werden, konnten wir keine aussagekräftigen Abstände zwischen den Klingen einzelner Partikel ermitteln. Um das Signal-Rausch-Verhältnis und die Auflösung zu erhöhen, verwendeten wir stattdessen einen templatfreien 3D-Partikelfusionsalgorithmus28, um Lokalisierungen aller identifizierten Kanäle zu fusionieren und ein Superpartikel aus dreifach markiertem PIEZO1 zu erzeugen (Abb. 1c). Mit Vorkenntnissen der Untereinheiten-Stöchiometrie haben wir bei der Erzeugung des Superteilchens eine dreifache Symmetrie erzwungen, da der Registrierungsalgorithmus dazu neigt, Regionen mit dichter Lokalisierung zuzuordnen 28, 29 (Extended Data Abb. 5a, b).

Die einzelnen Lokalisierungswolken im Superteilchen, die jeder Fluorophorposition entsprechen, sind nicht kugelförmig. Lokalisierungen von einem relativ starren Punktquellenemitter, die mit nahezu isotroper Auflösung abgebildet und mit einer Methode verschmolzen werden, die die Unsicherheit der anisotropen Lokalisierung berücksichtigt, sollten sich als Kugel auflösen, wie anhand markierter Untereinheiten des Kernporenkomplexes gezeigt28. Allerdings waren die PIEZO1-Blade-Lokalisierungswolken ungefähr um das Dreifache verlängert (Abb. 1c, d). Wir vermuteten, dass diese Verlängerung auf die Überlagerung von Konformationszuständen zurückzuführen ist, die möglicherweise auf die beträchtliche Flexibilität der distalen Klinge zurückzuführen sind. Im Vergleich zum gemittelten Schnappschuss, der in Strukturmodellen bereitgestellt wird, ergibt sich daraus die interessante Möglichkeit, dass die Klingen einzelner Kanäle nicht konformativ einheitlich sind. Als nächstes isolierten wir die mit jedem der drei Rotorblätter verbundenen Lokalisierungswolken und berechneten den durchschnittlichen paarweisen Abstand zu allen Lokalisierungen in benachbarten Rotorblättern (Abb. 1d, e). Verglichen mit dem aus der AlphaFold II-Strukturvorhersage berechneten Abstand zwischen den Klingen ist der wahrscheinlichste Abstand, der von PIEZO1 in einer Zelle gemessen wird, um 6,2 ± 5,9 nm größer (Mittelwert ± Standardabweichung) (Abb. 1e). Da das Strukturmodell membranfrei ist, deuten diese Daten auch darauf hin, dass die Plasmamembran eine ausreichende Biegespannung ausübt, um die Klingen von PIEZO1 im Ruhezustand auszudehnen.

Um diese beiden Hypothesen genauer zu testen, war eine direkte Beobachtung der Klingenpositionen einzelner PIEZO1-Moleküle erforderlich. Um dies zu erreichen, verwendeten wir MINFLUX, eine hochauflösende 3D-Fluoreszenzmikroskopiemethode, die eine echte isotrope Auflösung mit einem Lokalisierungsfehler von nur 5 bis 6 nm ermöglicht30,31,32. Unser System war mit einem 3D-Probenstabilisierungssystem ausgestattet, das die Probenposition aktiv mit einem Fehler von weniger als 2 nm32 fixiert und so die Unsicherheit durch Drift und Vibration minimiert. Wir haben Zellen genau wie für iPALM vorbereitet, die markierten Zellen mit MINFLUX abgebildet und dreifach markierte Partikel mit einem separaten automatisierten 3D-Identifizierungs- und Clustering-Algorithmus identifiziert (Abb. 2a; siehe Methoden). Die Rohlokalisierungen wurden zunächst in Cluster aufgeteilt und dann wurde jeder Cluster einzeln mit einem 3D-Gaußschen Mischungsmodell (GMM) angepasst, um die Position und Positionsunsicherheit jedes Fluorophorzentrums zu bestimmen33 (Abb. 2b). Wir haben PIEZO-Trimere benannt, indem wir Cluster aus drei Fluorophorpositionen ausgewählt haben, die räumlich um mehr als 100 nm von allen anderen erkannten Fluorophorpositionen getrennt sind. Für alle Lokalisierungscluster betrug der mittlere Fluorophor-Lokalisierungsfehler in x, y und z 6,0, 5,6 bzw. 5,4 nm (n = 5 Zellen und n = 123 Fluorophor-Positionen; Abb. 2d), weit weniger als die berechneten Abstände zwischen den Blättern ( Erweiterte Daten Abb. 1b).

a, MINFLUX-Bildgebung und PIEZO1-Trimer-Identifizierung. Repräsentativer konfokaler ×100-Scan (von n = 5 Zellen) einer HEK293-Zellmembran, die markiertes TCO*K 103 PIEZO1 exprimiert (Maßstabsbalken, 2 µm) (links). Die Farbe stellt die skalierte Intensität in jedem Detektor dar (650–685 nm (grün) und 685–720 nm (rot)). Cluster von Rohlokalisierungen (Spuren), dargestellt als 15-nm-Kugeln aus derselben Region (Maßstabsbalken, 2 µm) (Mitte). Vergrößerte Darstellung (3-nm-Kugeln) mit einfach beschriftetem (rot), doppelt beschriftetem (gelb) und dreifach beschriftetem (grün) PIEZO1, das vom Algorithmus identifiziert wurde (Maßstabsbalken, 20 nm) (rechts). b, Repräsentatives PIEZO1-Trimer. Rohe Lokalisierungen (3-nm-Kugeln), gefärbt durch DBSCAN-Cluster. Die Mittelpositionen wurden durch eine 3D-GMM-Anpassung bestimmt (weiße Kreise). c, Ostu-Schwellenwert-Superteilchen mit dreifacher Symmetrieerzwingung (n = 5 Zellen und n = 41 Moleküle). d, Histogramme des GMM-Anpassungsfehlers für jede Trimer-Fluorophor-Position (n = 41 Moleküle und n = 123 Fluorophor-Positionen). Bin-Breite = 1 nm. Die schwarze gestrichelte Linie zeigt den mittleren Anpassungsfehler an. e, Interblade-Abstände von PIEZO1 in einer Membran (graue Kreise; n = 41 Moleküle und n = 5 Zellen), die PIEZO2-Struktur (PDB-ID: 6KG7) an der nächstgelegenen ausgerichteten Position und die AlphaFold II-Vorhersage (E2JF22) (oben). Ein Schema von markiertem PIEZO1 in einer Membran ist ebenfalls dargestellt (unten). f, Abstände zwischen den Klingen pro waschmittellöslichem PIEZO1 (17,1 ± 4,0 nm; orangefarbene Kreise; n = 7 Moleküle), AlphaFold II-Vorhersage (schwarzer Kreis) und PIEZO1 in einer Membran (graue Kreise) (oben). Kolmogorov-Smirnov-Test: *P = 0,0106 und D = 0,662. Ein Schema der Proteinimmobilisierungsmethode und der Klingenverdichtung ist ebenfalls dargestellt (unten). g, Interblade-Abstände in einer Zelle, die 20 µM GsMTx-4 ausgesetzt ist (20,7 ± 6,6 nm; gelbe Kreise; n = 20 Moleküle und n = 3 Zellen), AlphaFold II-Vorhersage (schwarzer Kreis) und PIEZO1 in einer Membran (graue Kreise) (Spitze). Kolmogorov-Smirnov-Test: *P = 0,0126 und D = 0,4341. Ein Schema der Schaufelverdichtung von GsMTx-4 ist ebenfalls abgebildet (unten). Alle statistischen Tests sind zweiseitig. Die Werte in e–g sind Mittelwerte ± Standardabweichung

Quelldaten

Wir haben aus mit MINFLUX erhaltenen PIEZO1 TCO*K 103-Zentrumspositionen ein fusioniertes Superteilchen erzeugt und wie beim iPALM-Superteilchen erneut eine nicht-sphärische Verlängerung der Lokalisierungswolken beobachtet (Abb. 2c). Die minimale Unsicherheit der Fluorophorposition ermöglichte es uns auch, Entfernungen von einzelnen PIEZO-Kanälen direkt zu messen. Der durchschnittliche Abstand zwischen den Blättern zwischen den einzelnen Blättern an Position 103 beträgt 25,1 ± 7,4 nm (Mittelwert ± Standardabweichung) (Abb. 2e), was mit dem wahrscheinlichsten Abstand übereinstimmt, der mit iPALM gemessen wurde (Abb. 1e). Obwohl wir aufgrund der beobachteten Abflachung der PIEZO1-Membrankuppel in großen Lipidvesikeln erwartet hatten, dass sich die Klingen bis zu einem gewissen Grad ausdehnen würden, waren wir fasziniert, als wir feststellten, dass im Vergleich zum membranfreien AlphaFold II-Strukturmodell die distalen Bereiche der Klingen von PIEZO1 dehnt sich bei Einbettung in eine Zellmembran durchschnittlich um ca. 29 % aus. Wir stellen außerdem fest, dass die Standardabweichung der Abstände zwischen den Rotorblättern größer ist als der experimentelle Lokalisierungsfehler, was die Hypothese stützt, dass die Streuung der Abstände durch die intrinsische Flexibilität der Rotorblätter bestimmt wird. Zusammengenommen deuten diese Daten darauf hin, dass die Klingen von PIEZO1 im Ruhezustand deutlich ausgedehnt sind, vermutlich durch die Plasmamembran, und dass die distalen Bereiche der Klingen hochflexibel sind.

Als nächstes testeten wir, ob die beobachtete Klingenausdehnung in einer Zelle direkt durch die Plasmamembran vermittelt wird. Da den einzigen existierenden gelösten Strukturen von PIEZO1 das letzte Drittel der distalen Klinge fehlt, haben wir uns bisher auf Strukturmodelle verlassen, um das relative Ausmaß der Klingenausdehnung zu berechnen. Daher haben wir die membranfreie Kanalkonformation direkt gemessen und mit dem AlphaFold II-Strukturmodell verglichen. Zu diesem Zweck exprimierten, solubilisierten und reinigten wir das PIEZO1-Protein im Wesentlichen wie für Kryo-EM-Studien beschrieben4,5,7,17,21. Die distalen Klingen aus gereinigtem PIEZO1 wurden an Position 103 markiert und auf einer Bürstenoberfläche aus Polyethylenglykol (PEG) für die MINFLUX-Bildgebung in Gegenwart von Detergens immobilisiert (Abb. 2f, unten). Die Kanäle waren durch sparsames Pfropfen von Biotin-funktionalisiertem PEG im Durchschnitt um mehr als 100 nm voneinander entfernt, der minimale Abstand zwischen den Kanälen, der vom Segmentierungsalgorithmus gefordert wird. Wir beobachteten eine signifikante Abnahme des Abstands zwischen den Klingen im Vergleich zum Ruhezustand der Zelle (P = 0,0106, Kolmogorov-Smirnov-Test) auf 17,1 ± 4,0 nm (Mittelwert ± Standardabweichung), was sehr nahe dem aus der Strukturvorhersage gemessenen Abstand zwischen den Klingen liegt (Abb. 2f, Spitze). Diese Daten bestätigen, dass das AlphaFold II-Strukturmodell einen vernünftigen membranfreien Vergleich zu unseren Daten darstellt. Da die Entfernung von Zellbestandteilen, einschließlich der Membran, die Blätter verdichtet, deuten diese Daten erneut darauf hin, dass die Plasmamembran die Blätter in einer Zelle deutlich ausdehnt. Diese Experimente dienen in zweierlei Hinsicht auch als entscheidende Kontrolle für unsere Analysepipeline: Unsere Interblade-Messungen im Waschmittel stimmen mit bestehenden Strukturmodellen überein, und wir beobachteten eine große Konformationsverschiebung zwischen den einzelnen Bedingungen, wenn die Bildgebungs- und Segmentierungsparameter konstant gehalten wurden.

Die beobachtete Verdichtung der Klingen beim Entfernen der Plasmamembran und der Zellbestandteile lässt vermuten, dass auch Inhibitoren der Kanalaktivität über denselben Mechanismus wirken können. Einige PIEZO1-Inhibitoren wie Gadolinium, Streptomycin und Rutheniumrot blockieren offensichtlich den Ionenfluss durch die Pore1,34, andere, wie der Gating-Modifikator GsMTx-4, haben jedoch keinen nachgewiesenen Wirkungsmechanismus. GsMTx-4 ist ein aus der chilenischen Rosenvogelspinne isoliertes Peptidtoxin, das mechanosensitive Ionenkanäle weitgehend hemmt35,36. Die Gleichgewichtsbindungskonstante Kd von GsMTx-4 an eine Lipiddoppelschicht und die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) für PIEZO1 betragen beide etwa 2 µM (Ref. 36,37,38), was damit übereinstimmt, dass die Lipiddoppelschicht das primäre Ziel von ist Aktion. Darüber hinaus deuten Molekulardynamiksimulationen darauf hin, dass GsMTx-4 als mobile Reserve an Membranmaterial fungiert, indem es je nach Doppelschichtspannung zwischen flacher und tiefer Penetration wechselt und so als Puffer fungiert, der die lokale Membranspannung reduziert37. Der Nettoeffekt auf die Aktivität des PIEZO1-Kanals ist eine Rechtsverschiebung der Strom-Verschiebungs-Kurve36, was einen viel größeren Reiz erfordert, um den Kanal zu öffnen. Angesichts dieser Modelle und der geringen Größe des 35-Aminosäuren-Toxins (ca. 2 nm Durchmesser; PDB-ID: 1LU8) kamen wir zu dem Schluss, dass es sich möglicherweise direkt in die von PIEZO1 gebildete Membrankuppel einbetten und die lokale Biegespannung freisetzen kann Dadurch bleiben die Klingen ausgefahren (Abb. 2g, unten).

GsMTx-4 hat eine relativ geringe Membranaffinität und eine schnelle Off-Rate (koff ≈ 0,2 s−1) (Lit. 37). Um den vorübergehend gehemmten Konformationszustand bestmöglich zu bewahren, haben wir GsMTx-4 5 ​​Minuten lang in einer Konzentration (20 µM) angewendet, die zehnmal höher als die Gleichgewichtsbindungskonzentration war, und die Zellen schnell nachfixiert (siehe Methoden). Mit der gleichen MINFLUX-Bildgebungsmethode und dem gleichen Segmentierungsalgorithmus wie für frühere Experimente haben wir den Abstand zwischen den Schaufeln einzelner PIEZO1-Kanäle gemessen. In Gegenwart von GsMTx-4 betrug der durchschnittliche Abstand zwischen den Klingen 20,7 ± 6,6 nm (Mittelwert ± Standardabweichung), was im Vergleich zum zellulären Ruhezustand (P = 0,0126, Kolmogorov-Smirnov-Test) deutlich verringert ist und sehr nahe am Detergenz- Vorhersage des solubilisierten Zustands und der membranfreien Struktur (Abb. 2g, oben). Diese Daten deuten darauf hin, dass die Freisetzung von Membranbiegespannung eine Blattverdichtung verursacht und einen grundlegenden Hemmmechanismus für GsMTx-4 darstellt. Da GsMTx-4 offenbar speziell auf die Lipiddoppelschicht einwirkt, deuten diese Daten auch darauf hin, dass die Klingenexpansion hauptsächlich durch die Plasmamembran und nicht durch Anbindung an das Zytoskelett oder die extrazelluläre Matrix vermittelt wird39,40.

Als nächstes konzentrierten wir uns darauf, inwieweit die scheinbare Ausbreitung von Konformationszuständen durch die Flexibilität der Klingen bestimmt wird. Obwohl die beobachtete Heterogenität der Klingenausdehnung teilweise auf lokale Unterschiede in den Membraneigenschaften wie Topographie und Biegemodul zurückzuführen sein könnte, sollte sich die lange Klinge der Transmembrandomänen innerhalb der Grenzen der Plasmamembran ungefähr wie ein flexibler elastischer Stab verhalten. Ablenkungen durch zufällige Wärmeenergie an den distalen Enden sollten größer sein als in der Nähe der Kanalmitte. Tatsächlich sagen physikalische Modelle voraus, dass zumindest ein Teil von PIEZO1 ähnlich flexibel sein könnte wie eine Lipiddoppelschicht, was impliziert, dass allein thermische Schwankungen zu erheblichen Verformungen der Form von PIEZO1 führen können (Ref. 18,19). Angesichts der großen Verteilung der Konformationszustände fragten wir uns jedoch, ob bestimmte Strukturmerkmale für diese mechanischen Eigenschaften verantwortlich sein könnten.

Die Steifigkeit der Tertiärstruktur eines Proteins wird hauptsächlich durch die Stärke der Aminosäurewechselwirkungen an Bindungsschnittstellen bestimmt41,42. Jede Klinge von PIEZO1 kann in neun PIEZO-Wiederholungsdomänen unterteilt werden, wobei jede Wiederholung einen Cluster aus vier gepackten Transmembranhelices bildet, die Bindungsschnittstellen zwischen Wiederholungen enthalten (Abb. 3a). Unter Verwendung der AlphaFold II-Struktur des PIEZO1-Blades haben wir die inter-PIEZO-Wiederholungsbindungsenergie (−∆G) für Domänenschnittstellen43 berechnet, mit und ohne den Beitrag intrazellulärer und extrazellulärer Schleifen, einschließlich Domänen, von denen erwartet wird, dass sie die Bindungsstärke zwischen Domänen erhöhen, wie z des Balkens (Abb. 3b). Wir beobachteten eine dramatische, abgestufte Abnahme von −∆G entlang der proximalen bis distalen Achse der Klinge, was mit den Bindungsenergien der PIEZO2-Wiederholungsdomänen übereinstimmt, die direkt aus der Kryo-EM-Struktur berechnet wurden. Eine niedrige Bindungsenergie ist besonders für die distale Wiederholung I erkennbar, die nur an eine andere PIEZO-Wiederholung bindet und stärker der Plasmamembran ausgesetzt ist. Die durchschnittliche Differenz der freien Energie zwischen Wiederholung F – am Rand der aufgelösten PIEZO1-Kryo-EM-Strukturen – und Wiederholung I – der am weitesten entfernten Wiederholung – beträgt 28,6 kcal mol−1 (16,9 kBT). In einer komplexen Membran-Wasser-Umgebung sind die tatsächlichen Grenzflächenbindungsenergien wahrscheinlich unterschiedlich, aber der allgemeine Trend deutet darauf hin, dass proximale Wiederholungen in der Nähe der Porendomäne steifer sind als distale Wiederholungen und weniger anfällig für Biegungen durch die Plasmamembran.

a, PIEZO-Wiederholungsdomänen von PIEZO1 (links; AlphaFold II E2JF22) und PIEZO2 (rechts; PDB-ID: 6KG7), mit markierten Positionen. b, Inter-PIEZO-Wiederholungsbindungsenergie für PIEZO1 (blau; AlphaFold II E2JF22) und PIEZO2 (orange; PDB-ID: 6KG7) mit ausschließlichem Beitrag von Transmembrandomänen (TMDs) oder mit zusätzlichem Beitrag geordneter Schleifen. Markierte Wiederholungen werden durch schwarze Pfeile gekennzeichnet. c, Streudiagramm der durchschnittlichen Abstände zwischen den Klingen an der proximalen Klingenposition 670 (17,8 ± 4,2 nm; violette Kreise; n = 35 Moleküle und n = 5 Zellen) im Vergleich zur distalen Position 103 (25,1 ± 7,4 nm; graue Kreise; n = 41 Moleküle). und n = 5 Zellen) gemessen mit MINFLUX in einer Zellmembran. Kolmogorov-Smirnov-Test: ****P = 0,000087 und D = 0,5157. Die Abstände werden als Mittelwert ± sd d, Varianz und 95 %-Konfidenzintervall der durchschnittlichen Abstände zwischen den Rotorblättern an den Positionen 103 und 670 aus den Streudiagrammdaten in Teil c angezeigt. F-Test der Varianzgleichheit: P = 0,000535 und F-Statistik = 3,10. e, Histogramme des GMM-Anpassungsfehlers für alle identifizierten dreifach markierten PIEZO1-Moleküle an Position 103 (grau; n = 123 Fluorophorpositionen) und Position 670 (lila; n = 105 Fluorophorpositionen). Bin-Breite = 1 nm. Unterschied im mittleren GMM-Anpassungsfehler Δσ x = 0,66 nm, Δσ y = 0,59 nm und Δσ z = 0,69 nm. f, Histogramme der Zwischenblattwinkel für identifizierte dreifach markierte PIEZO1-Moleküle, gruppiert um 10 nm und angepasst an eine Gaußsche Funktion an Position 103 (56,4 ± 27,8 nm; R2 = 0,84) (oben) und Position 670 (58,2 ± 18,5 nm; R2 = 0,94). ) (Mitte). Die Werte werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Ein Streudiagramm der Änderung der Winkel zwischen den Schaufeln gegenüber der Symmetrie (60°) für die Positionen 103 und 670 ist ebenfalls dargestellt (unten). Mann-Whitney-Test: **P = 0,0059, U = 5090. Fehlerbalken werden als Median und 95 %-Konfidenzintervall angezeigt. Alle statistischen Tests sind zweiseitig.

Quelldaten

Um die Flexibilität an proximaleren Klingendomänen innerhalb aufgelöster Kryo-EM-Strukturen zu messen, haben wir PIEZO1 mit TCO*K an der Aminosäure 670 markiert, die in einer extrazellulären Schleife der Wiederholung F liegt (Extended Data Abb. 1b und 2b). Bei der Messung und Analyse mit unserer MINFLUX-Pipeline beobachteten wir eine statistisch signifikante Abnahme der Abstände zwischen den Schaufeln im Vergleich zu Wiederholung I (P = 0,000087, Kolmogorov-Smirnov-Test) (Abb. 3c). Bemerkenswert ist, dass die Varianz der durchschnittlichen Abstände zwischen den Klingen zwischen den Positionen 103 und 670 deutlich verringert war (Abb. 3d), was darauf hindeutet, dass bei Wiederholung F ein kleinerer Bereich von Konformationszuständen besetzt ist und dass es einen großen Unterschied in der Flexibilität gibt. Die GMM-Anpassungsfehler sind für jede Bedingung nahezu gleich (Änderung des mittleren GMM-Anpassungsfehlers (Δσ) x = 0,66 nm, Δσ y = 0,59 nm und Δσ z = 0,69 nm; Abb. 3e) und sind daher nicht für den offensichtlichen Unterschied verantwortlich in den mechanischen Eigenschaften. Im Einklang mit der verminderten Flexibilität war der Winkel zwischen den drei Fluorophorpositionen auf jedem identifizierten PIEZO1-Molekül bei Wiederholung F deutlich symmetrischer als bei Wiederholung I (Abb. 3f). Wir vermuten, dass solche Flexibilitätsunterschiede der Grund dafür sind, dass die distale Klinge noch nicht durch Kryo-EM gelöst werden konnte.

Als nächstes untersuchten wir das relative Ausmaß, in dem jeder Abschnitt der Klinge durch die Plasmamembran ausgedehnt wird. Verglichen mit den membranfreien Strukturen und Vorhersagen ist die Klinge bei der proximalen Wiederholung F nur um 2,4 ± 4,2 nm ausgedehnt, verglichen mit 5,9 ± 7,4 nm bei der distalen Wiederholung I (Mittelwert ± Standardabweichung) (Abb. 3c). Dieser durchschnittliche Anstieg um mehr als das Doppelte steht im Einklang mit dem großen Unterschied in der energetischen Stabilität dieser Bereiche und dem daraus resultierenden Unterschied in der Flexibilität. Der durchschnittliche Abstand zwischen den Klingen der Position 670 in einer Zelle liegt zwischen dem der vermutlich spannungsfreien, durch Detergenz solubilisierten Struktur und der stark gespannten, abgeflachten Kryo-EM-Struktur von PIEZO1, gelöst von außen nach außen in 10-nm-Lipidvesikeln21, was einen zusätzlichen Beweis liefert dass wir einen Ruhezustand der Klingenexpansion durch die Plasmamembran erfasst haben.

Als nächstes fragten wir, ob wir induzierte Änderungen der Klingenflexibilität an einer einzelnen markierten Position messen könnten. Zu diesem Zweck veränderten wir die Membransteifigkeit, indem wir die Lipidzusammensetzung der Plasmamembran veränderten. Gesättigte Fettsäuren wie Margarinsäure erhöhen die Membransteifigkeit und -viskosität44 und sollten folglich das Ausmaß der Schaufelverschiebung durch zufällige thermische Bewegung verringern. Wir haben die Plasmamembran von Zellen, die PIEZO1 exprimieren, mit 300 µM Margarinsäure angereichert, mit MINFLUX abgebildet, und festgestellt, dass die distalen Klingen eine deutlich geringere Variation der Abstände zwischen den Klingen aufwiesen, was mit einer offensichtlichen Abnahme der Stärke der Klingenschwankungen übereinstimmt (Extended Data Abb. 6b). ). Diese Daten stützen weiterhin die Beobachtung, dass die Ausbreitung von Konformationszuständen an der distalen Klinge durch die intrinsische Flexibilität der Klinge gesteuert wird. Wir beobachteten keine signifikante Änderung des Abstands zwischen den Klingen bei der Anreicherung mit Margarinsäure (Erweiterte Daten, Abb. 6a). Die mathematische Modellierung von PIEZO1 in der Plasmamembran sagt voraus, dass eine erhöhte Membransteifigkeit auch die Klingen ausdehnen und die scheinbare Kanal-Gating-Schwelle verringern sollte4; Elektrophysiologische Daten deuten jedoch umgekehrt darauf hin, dass Margarinsäure die Gating-Schwelle erhöht45. Diese Daten legen nahe, dass der Einfluss der Membranzusammensetzung auf die Konformation von PIEZO1 wahrscheinlich nuancierter ist als anhand der Modellierung allein vorhergesagt und möglicherweise eine direkte Proteinbindung und -modulation beinhaltet.

GsMTx-4 hemmt die Aktivität des PIEZO-Kanals und unsere Daten deuten darauf hin, dass es die Blätter von PIEZO1 verdichtet, indem es die Membranbiegespannung freisetzt. Umgekehrt aktiviert die Krafteinwirkung auf eine Zellmembran PIEZO1 (Ref. 1,2), vermutlich durch seitliche Membranspannung und Verformung der Membrankuppel4. Daher haben wir uns darauf konzentriert, inwieweit sich die Klingen ausdehnen, wenn die Plasmamembran gedehnt wird. Wir suchten nach einem mit der MINFLUX-Bildgebung kompatiblen Reiz, der die Membran gleichmäßig ausdehnt und PIEZO1 direkt aktiviert.

Eine hypotone extrazelluläre Umgebung erhöht das Zellvolumen durch osmotische Schwellung. Bei einer endlichen Oberfläche übt die Schwellung eine Spannung auf die Plasmamembran aus46. Osmotische Schwellung induziert auch den Ca2+-Einstrom durch PIEZO1 (Lit. 47), wir fanden jedoch keine elektrophysiologischen Beweise dafür, dass es den Kanal unter normalen Bedingungen direkt aktiviert. Mechanisch hervorgerufene PIEZO1-Ströme werden bei negativen Membranpotentialen schnell inaktiviert (τInaktivierung = 10–30 ms), während die Rate der osmotischen Schwellung in HEK293-Zellen langsam ist und ihr Spitzenvolumen in etwa 2,5 Minuten erreicht (Ref. 48). Wir vermuteten daher, dass eine schnelle Inaktivierung die Kanalaktivierung als Reaktion auf eine osmotische Schwellung verdeckt. Osmotische Schwellung löst auch einen nach außen gerichteten Chloridstrom durch den allgegenwärtigen volumenregulierten Anionenkanal SWELL1 aus (Ref. 49,50), wodurch die durch PIEZO1 hervorgerufenen Ströme weiter maskiert werden. Wir haben diese beiden Probleme umgangen, indem wir die osmotisch induzierte PIEZO1-Aktivierung in Swell1-Knockout-HEK293-Zellen mit einer Ganzzellspannungsklemme bei +80 mV gemessen haben, bei der die τ-Inaktivierung etwa zehnmal langsamer ist als die negativen Haltepotentiale, bei denen PIEZO-Ströme typischerweise aufgezeichnet werden physiologische Bedingungen simulieren51. Wir beobachteten große PIEZO1-abhängige Ströme, die den zeitlichen Verlauf der Zellschwellung verfolgten (Abb. 4a), was darauf hindeutet, dass die Membrandehnung durch osmotische Schwellung PIEZO1 direkt aktivieren kann.

a, Repräsentative Elektrophysiologie ganzer Zellen bei +80 mV als Reaktion auf eine hypotonische extrazelluläre Lösung von Swell1-Knockout-HEK293F-Zellen, transfiziert mit PIEZO1 und einer nicht transfizierten Kontrolle. b, Klingenausdehnung an Position 103 aufgrund osmotischer Schwellung (34,7 ± 8,8 nm; rote Kreise; n = 14 Moleküle und n = 4 Zellen) im Vergleich zu einer unstimulierten Zelle (25,7 ± 8,6 nm; graue Kreise; n = 44 Moleküle und n =). 5 Zellen). Kolmogorov-Smirnov-Test: *P = 0,0169 und D = 0,474. c, Änderung der projizierten Fläche, berechnet aus dem Zirkumradius unter Verwendung der Abstände in Teil b von der osmotischen Schwellung (1.651 ± 770 nm2; rote Kreise), einer nicht stimulierten Zelle (999 ± 726 nm2; graue Kreise) und der AlphaFold II-Vorhersage (411 nm2; schwarzer Kreis). ). Kolmogorov-Smirnov-Test: *P = 0,0264 und D = 0,4513. d, Repräsentative Elektrophysiologie ganzer Zellen bei +80 mV als Reaktion auf 50 µM Yoda1 von Swell1-Knockout-HEK293F-Zellen, transfiziert mit PIEZO1 und einer nicht transfizierten Kontrolle. Die chemische Struktur von Yoda1 ist ebenfalls dargestellt (oben links). e, Maximale Ganzzellströme aus osmotischer Schwellung und Yoda1 (n = jeweils 5 Zellen (120 mOsm) und n = jeweils 3 Zellen (Yoda1)). Die Werte werden als Mittelwert ± SEM f, Interblade-Abstände an Position 103 mit 50 µM Yoda1 (27,07 ± 6,60 nm; dunkelgraue Kreise; n = 69 Moleküle und n = 3 Zellen) und im unstimulierten Zustand (25,13 ± 7,39 nm; hellgrau) angezeigt Kreise; n = 41 Moleküle und n = 5 Zellen) (Kolmogorov-Smirnov-Test: P = 0,4712 und D = 0,1668) und an Position 670 mit 50 µM Yoda1 (19,71 ± 3,01 nm; dunkelviolette Kreise; n = 22 Moleküle und n = 5 Zellen) und der unstimulierte Zustand (17,77 ± 4,19 nm; hellviolette Kreise; n = 35 Moleküle und n = 5 Zellen) (Kolmogorov-Smirnov-Test: *P = 0,0481 und D = 0,3714). Zur Hervorhebung der Präzision werden zwei signifikante Ziffern verwendet. NS, nicht signifikant. g, Zusammenfassung der Ergebnisse. Die Werte in b,c,f werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt. Alle statistischen Tests sind zweiseitig.

Quelldaten

Als nächstes setzten wir Zellen, die fluoreszierend markiertes TCO*K 103 PIEZO1 exprimierten, 2,5 Minuten lang einer hypotonischen Lösung aus und fixierten die Zellen sofort am Höhepunkt der Zellschwellung in einem hypotonischen Fixiermittel, um den aktivierten Zustand zu bewahren. Bei der Messung mit MINFLUX erhöhten sich die durchschnittlichen Abstände zwischen den Klingen signifikant von 25,7 ± 8,6 nm im Ruhezustand auf 34,7 ± 8,8 nm im geschwollenen Zustand (Mittelwert ± Standardabweichung; P = 0,0169, Kolmogorov-Smirnov-Test), was im Durchschnitt fast doppelt so groß ist als Ausmaß der ruhenden Klingenausdehnung allein aufgrund der Membranbiegespannung (Abb. 4b). Diese Ausdehnung entsprach einer signifikanten Vergrößerung der projizierten Gesamtfläche des Kanals im Vergleich zu den membranfreien Strukturmodellen und dem Zustand der Ruheausdehnung (Abb. 4c), was darauf hindeutet, dass sich die PIEZO1-Kuppel als Reaktion auf diesen Membrantyp abflacht strecken. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Membrandehnung durch osmotische Schwellung, die zur Aktivierung des Kanals ausreicht, auch die Klingen von PIEZO1 streckt.

Wir haben auch den niedermolekularen Agonisten Yoda1 getestet, der wie die osmotisch induzierte Zellschwellung einen robusten PIEZO1-abhängigen Ca2+-Eintritt in die Zellen bewirkt52. Yoda1 verlangsamt die Rate der Kanalinaktivierung (Extended Data Abb. 3d, e) und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Kanalöffnung erheblich, wenn keine Kraft ausgeübt wird52. Der genaue Mechanismus, durch den Yoda1 PIEZO1 quält, ist unbekannt, aber molekulardynamische Simulationen und Mutagenese legen nahe, dass es in einer Tasche zwischen den PIEZO1-Wiederholungen A und B53 bindet. Um das relative Ausmaß der Kanalaktivierung mit der osmotischen Schwellung zu vergleichen, haben wir Ganzzellströme gemessen, die durch im Bad aufgetragene 50 µM Yoda1 auf Swell1-Knockout-HEK293-Zellen hervorgerufen wurden, die auf einem positiven Membranpotential gehalten wurden (Abb. 4d). Wir beobachteten auch große (mehr als 1 nA) Ströme von durch Bad durchströmtem Yoda1 ohne mechanische Stimulation, was darauf hindeutet, dass diese beiden unterschiedlichen Reize beide PIEZO1 robust aktivieren (Abb. 4e).

Als nächstes haben wir Yoda1-induzierte Änderungen der PIEZO1-Zwischenblattabstände an Position 103 mit MINFLUX gemessen. Wenn Zellen mit 50 µM Yoda1 inkubiert und in Gegenwart von 50 µM Yoda1 fixiert wurden, erhöhte sich der durchschnittliche Abstand zwischen den Klingen im Durchschnitt um 1,95 nm (P = 0,4712, Kolmogorov-Smirnov-Test; Abb. 4f). Angesichts der breiten Streuung der Konformationszustände aufgrund der Domänenflexibilität konnten wir an dieser Position keine statistisch signifikante Änderung des Abstands beobachten. Daher haben wir auch die Yoda1-induzierte Klingenbewegung an Position 670 gemessen, einer steiferen Stelle innerhalb der Klinge, die einen kleineren Bereich von Konformationszuständen einnimmt (Abb. 3). Hier beobachteten wir eine statistisch signifikante Änderung des durchschnittlichen Abstands zwischen den Rotorblättern von durchschnittlich 1,94 nm (P = 0,0481, Kolmogorov-Smirnov-Test), die im Durchschnitt bemerkenswert nahe bei der Yoda1-induzierten Abstandsänderung an Position 103 liegt (Abb. 4f). . Diese Daten deuten darauf hin, dass Yoda1 die Klingen direkt ausdehnt und beim Binden eine kleine, stereotype Konformationsbewegung auslöst. Diese Daten unterstreichen auch die Leistungsfähigkeit unserer Technik zur genauen Beobachtung molekularer Bewegungen im Nanometerbereich.

In dieser Studie haben wir mithilfe direkter nanoskopischer Fluoreszenzbildgebung gezeigt, wie die zelluläre Umgebung die Konformation von PIEZO1 formen kann. Im Vergleich zu veröffentlichten Strukturen werden die Klingen von PIEZO1 durch die Plasmamembran erheblich erweitert, was mit quantitativen Vorhersagen der elastischen Eigenschaften der PIEZO-Membrankuppel übereinstimmt4,8,18,19. Wir haben gezeigt, dass die Klingen von PIEZO1 hochflexibel sind, was wahrscheinlich wichtige Auswirkungen auf die Eigenschaften der Kraftübertragung von der Membran auf die Porendomäne hat und erklären könnte, warum die distalen Domänen von PIEZO1 nicht durch Kryo-EM aufgelöst wurden. Wir haben auch gezeigt, wie die Klingenausdehnung durch chemische und mechanische Modulatoren mit der Kanalaktivierung korrespondiert. Zusammengenommen bilden diese Daten eine Grundlage für das Verständnis, wie PIEZO1 in einer zellulären Umgebung aktiviert wird (Abb. 4g).

In Experimenten zur Messung der PIEZO1-Aktivität bei nomineller Spannungsfreiheit ist PIEZO1 spontan in einer Zellmembran aktiv (Ruhewahrscheinlichkeit Popen ≈ 0,5 %)54,55 und die Anwendung von GsMTx-4 scheint diese spontane Aktivität zu hemmen36. Wir haben gezeigt, dass sowohl die Anwendung von GsMTx-4 als auch die Entfernung der Membran mit einem Reinigungsmittel die Klingen von PIEZO1 im Vergleich zum zellulären Ruhezustand kontrahieren. Diese Daten legen nahe, dass membranfreie Strukturmodelle einen Zustand darstellen, in dem Popen vermutlich Null ist und die Gesamtkonformation ihre niedrigste Energieform aufweist. Wir haben auch gezeigt, dass die Plasmamembran in Übereinstimmung mit früheren physikalischen Modellen direkt dazu beiträgt, die Klingen von PIEZO1 im Ruhezustand auszudehnen4,18,19. Das Ausmaß dieser membranvermittelten Expansion ist außergewöhnlich groß, eine Eigenschaft, die durch die hohe Klingenflexibilität verliehen wird. Eine wichtige Konsequenz der geringen Steifigkeit besteht darin, dass weniger äußere Kraft erforderlich ist, um den Kanal abzuflachen und zu schließen. Dies verleiht nicht nur eine hohe Empfindlichkeit gegenüber Membranspannung4,18,19, sondern könnte es PIEZO1 auch ermöglichen, häufiger einen offenen Zustand ohne äußere Kraft abzutasten. Wie die Ruhespannung der Spitzenverbindungen, die auf den Transduktionskanalkomplex der Haarzellen im Innenohr ausgeübt wird56,57,58,59, kann eine große Ausdehnung der ruhenden Klinge, die durch flexible Klingendomänen ermöglicht wird, ein grundlegender Mechanismus sein, um den Kanal in einem reaktionsfähigen Zustand zu halten und zu übertragen ein bestimmter Bereich der Spannungsempfindlichkeit.

Wir vermuten, dass die Klingen möglicherweise nicht gleichmäßig flexibel sind, eine Eigenschaft, die durch die variable Bindungsstärke zwischen Domänen verursacht werden könnte (Abb. 3b). Diese Berechnungen haben wichtige Auswirkungen auf die Gesamtstruktur und Funktion der Membrankuppel, die kollektive Struktur der Plasmamembran und das PIEZO-Protein4. Abgestufte Änderungen der Nachgiebigkeit zu den distalen Enden der Klingen hin können einen reibungslosen mechanischen Übergang zwischen der starren Mitte des Kanals und der relativ flexiblen Plasmamembran ermöglichen. Die nachgiebigere distale Kante der PIEZO1-Kuppel kann es dem Kanal auch ermöglichen, mechanische Geräusche geringer Stärke in einer Zelle zu dämpfen. Die distalen Teile der Klingen scheinen sich innerhalb eines einzelnen Kanalkomplexes relativ unabhängig voneinander zu bewegen, selbst wenn Membranspannung vorhanden ist (Erweiterte Daten, Abb. 7). Diese Daten legen nahe, dass sich die distalen Klingen während des Anschnitts nicht kooperativ bewegen. Zukünftige Studien könnten testen, ob und wie sich eine abgestufte Klingenflexibilität auf die Proteinfunktion auswirkt, indem sie die Bindungsstärke zwischen PIEZO-Domänen durch Punktmutagenese oder Doppel-Cystein-Vernetzung verändert, wobei letzteres möglicherweise eine akute und reversible Manipulation mechanischer Eigenschaften ermöglicht.

Die offensichtliche Korrelation zwischen dem Ausmaß der Blattausdehnung und der Kanalaktivität zeigt die Bedeutung der lokalen Membranumgebung für die Bestimmung der Kanaleigenschaften. Beispielsweise kann eine Änderung der Membranlipidzusammensetzung die Anschnitt- und Inaktivierungseigenschaften von PIEZO1 modulieren (Lit. 45), und wir haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Membransteifigkeit mit der gesättigten Fettsäure Margarinsäure die mechanischen Eigenschaften von Klingen verändern kann (Extended Data Abb. 6). Die Lipidzusammensetzung von Membranmikrodomänen oder die lokale Membrantopographie könnten die Öffnungswahrscheinlichkeit des Ruhekanals über Klingenkonformationsänderungen direkt modulieren und folglich die zum Öffnen der Pore erforderliche Kraft verändern. Solche Merkmale könnten die mechanischen Reaktionseigenschaften des Kanals abstimmen und könnten an speziellen Stellen der Mechanotransduktion vorhanden sein, wie etwa Merkelzell-Neurit-Komplexen11,60. Beispielsweise können ultrastrukturelle Merkmale, wie die filamentösen Verbindungen zwischen Haarfollikel-Epithelzellen und lanzettlichen Mechanorezeptor-Enden mit niedriger Reizschwelle61, dazu dienen, die Menge an Biegespannung zu modulieren, die auf die Klingen von PIEZO2-Proteinen ausgeübt wird, und möglicherweise die Kanalaktivität zu verändern, um die jeweilige anatomische Struktur zu verknüpfen Eigenschaften von Mechanorezeptoren auf ihre charakteristischen funktionellen Ergebnisse.

Die hier beschriebenen Daten zeigen, dass die Konformationsdynamik einzelner Membranproteine ​​mit direkter Fluoreszenznanoskopie auf der Ebene einzelner Moleküle beobachtet wurde. Obwohl Methoden wie Einzelmolekül-FRET relative Fluorophorpositionen in Membranproteinen mit Nanometergenauigkeit innerhalb des räumlichen Abstands auflösen können, der für die Resonanzenergieübertragung erforderlich ist62,63,64, meldet unser Ansatz absolute Positionen ohne einen eingeschränkten Aktionsradius. Wir gehen davon aus, dass diese Methoden eine Grundlage für den Einsatz der Fluoreszenz-Nanoskopie in der Strukturbiologie einzelner Moleküle bilden werden, insbesondere für Proteine ​​mit hochflexiblen Domänen oder für Proteine, die sich mit aktuellen Methoden der Elektronenmikroskopie nicht untersuchen lassen. Eine erhöhte effektive Markierungseffizienz mit Methoden wie DNA-PAINT65, ein erhöhtes Signal-Rausch-Verhältnis mit Mikroskopiemethoden wie MINSTED66 und eine verbesserte Fähigkeit, komplexe Bilddatensätze mit fortschrittlicheren Rechenmethoden zu verarbeiten, werden wahrscheinlich unsere Fähigkeit verbessern, die Struktur der im Komplex eingebetteten Proteine ​​aufzulösen Milieu einer Zelle.

Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet. Die Experimente waren nicht randomisiert und die Forscher waren hinsichtlich der Zuordnung während der Experimente und der Ergebnisbewertung nicht blind.

Die kodierende Sequenz von Maus-PIEZO1 (E2JF22, UniprotKB-Eintrag) wurde codonoptimiert, synthetisiert und in das pcDNA3.1-Plasmid kloniert. An den angegebenen Aminosäurepositionen wurde mittels ortsgerichteter Mutagenese mit dem Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit (New England Biolabs) ein Amber-Stoppcodon (TAG) eingefügt. Die kodierende Sequenz für HaloTag wurde aus dem pHTC HaloTag CMV-neo-Vektor (Promega) amplifiziert und die kodierende Sequenz für mEos3.2 wurde aus dem mEos3.2-ER-5-Vektor (Addgene) amplifiziert. Die kodierende Sequenz für Strep-Tag II wurde codonoptimiert und synthetisiert (IDT). Die HaloTag- und mEos3.2-Sequenzen wurden zusammen mit dem Strep-Tag II separat mit dem NEBuilder HiFi DNA Assembly Kit (New England Biolabs) in das mPiezo1-pcDNA3.1-Plasmid subkloniert. Die Sequenz jedes Plasmids wurde vor der Verwendung durch Gesamtplasmidsequenzierung verifiziert. Alle DNA-Sequenzen wurden in der SnapGene-Software (Dotmatics) angezeigt und entworfen.

Die Zellen wurden für die iPALM- und MINFLUX-Bildgebung gleich vorbereitet und markiert (Extended Data Abb. 2). HEK293F-Zellen (Expi293, Thermo Fisher) wurden in Expi293-Expressionsmedium (Thermo Fisher) bis zu einer Dichte von 1–2 × 106 Zellen pro ml gezüchtet. Die Zellen wurden stets bei 37 °C mit 8 % CO2 gehalten und bei 125 U/min auf einem Rotator mit einem Umlaufdurchmesser von 19 mm geschüttelt. Mit dem MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza) wurde bestätigt, dass die Zellen frei von Mykoplasmen waren. Vor der Transfektion wurden die Zellen 3 Minuten lang bei 100 g zentrifugiert, in frisches Medium mit 250–500 µM trans-Cyclooct-2-en-l-lysin (axiales Isomer) (SiChem) ausgetauscht und in eine Kulturflasche überführt. Jeder Kolben wurde mit einem 1:1-Verhältnis von pNEU-hMbPylRS-4xU6M15 und einem PIEZO1-Expressionskonstrukt in einer Gesamtkonzentration von 2 µg ml-1 transfiziert, wobei entweder 40 kDa PEI (PolySciences) oder EndoFectin Expi293-Transfektionsreagenz (GeneCopeia) verwendet wurde. Den transfizierten Zellen wurde erlaubt, 24–36 Stunden lang zu exprimieren. Die Zellen wurden dann zweimal iterativ pelletiert und in frischem Expi293-Medium resuspendiert und 30 Minuten lang kultiviert, um überschüssiges TCO*K aus den Zellen diffundieren zu lassen.

Um die Zellen zu markieren, wurden 1,5 × 106 Zellen in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und das Volumen mit frischem Expi293-Medium, das eine Endkonzentration von 1 % w/v Blockierungsreagenz enthielt, entweder BSA (Sigma) oder, auf 1 ml gebracht Roche-Blockierungsreagenz (Roche). Die Zellen wurden vorsichtig gemischt und 3 Minuten lang bei Raumtemperatur blockieren gelassen, 2 Minuten lang bei 100 g zentrifugiert und in Expi293-Medium + 1 % w/v Blockierungsreagenz + 4 µM Tetrazin – Alexa Fluor 647 resuspendiert. Die Zellen wurden 10 Minuten lang inkubiert Min. bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, mit gelegentlichem gründlichem Mischen. Um überschüssiges Fluorophor zu entfernen, wurden die Zellen pelletiert und dreimal in Expi293-Medium + 1 % Blockierungsreagenz und dann einmal in Expi293-Medium ohne Blockierungsreagenz gewaschen. Bei den Waschschritten wurde größter Wert darauf gelegt, so schonend wie möglich zu sein. Die Zellen wurden schließlich in Expi293-Medium auf eine Konzentration von 0,3 × 106 Zellen pro ml verdünnt und direkt auf Deckgläser ausplattiert.

Kreisförmige Deckgläser mit einem Durchmesser von 25 mm und eingebetteten Goldmarken mit breitem Spektralband (600 ± 100 nm) unter einer 50 nm dicken SiO2-Schicht (Hestzig) wurden zunächst durch Waschen mit 100 % Ethanol und Trocknen mit einem Strom gereinigter Luft hergestellt. Anschließend wurden die Oberflächen der Deckgläser durch 5-minütige Inkubation mit 1 M KOH hydrophil gemacht. Die Deckgläser wurden in MilliQ-Wasser gewaschen und erneut mit einem Strom gereinigter Luft getrocknet. Von den markierten Zellen mit 0,3 × 106 Zellen pro ml in Expi293-Medium wurden 400 µl auf die Deckgläser plattiert und 15 Minuten lang bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator an der Glasoberfläche haften gelassen.

Nachdem die Zellen angeklebt waren, wurden sie mit vorgewärmter 37 °C 1× Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ohne Ca2+ oder Mg2+ gewaschen und in vorgewärmtem 37 °C 1× HBSS mit 0,8 % Paraformaldehyd (PFA) und 0,1 fixiert % Glutaraldehyd für 10 Min. In diesem Stadium wurde besonders darauf geachtet, die Lösungen vorsichtig zu pipettieren, um die Zellen nicht mechanisch zu stören. Die Zellen wurden gewaschen und in 1× HBSS mit 50 mM Tris (pH 7,4) 5 Minuten lang gequencht und dann ausgiebig in 1× HBSS gewaschen.

Das Deckglas wurde in einen isotonischen Bildgebungspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM NaCl, 3,33 % Glucose, 100 mM Cysteamin, 40 µg ml−1 Rinderleberkatalase und 100 µg ml−1 Glucoseoxidase aus ausgetauscht Aspergillus niger, Typ VII) durch aufeinanderfolgendes Waschen gereinigt und dann mit einem einfachen 25 mm dicken KOH-behandelten Deckglas überzogen und mit 5-minütigem Epoxidharz (ITW Performance Polymers) und Vaseline (Unilever) versiegelt. Das Deckglas wurde wie zuvor beschrieben auf dem Mikroskop montiert26. Die Zellen wurden am selben Tag vorbereitet und abgebildet.

Kurz gesagt, 1–2 Zellen wurden im Bildgebungsfeld des iPALM-Mikroskops isoliert und das Instrument wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung eingebetteter Gold-Referenzmarken kalibriert26. Die Bildgebung wurde mit der benutzerdefinierten LabView-Software wie zuvor beschrieben26 durchgeführt. Um das Blinken von Alexa Fluor 647 zu erfassen, wurden Proben mit 30 ms Belichtung und 3 kW cm-2 640 nm Laseranregung für 60.000 Bilder abgebildet, die mit drei EMCCD-Kameras (iXon 897, Andor) aufgenommen wurden. Obwohl C-terminal markiertes mEos3.2 aufgrund von effektiver Markierungsineffizienz und Bildregistrierungsfehlern nicht in der nachgelagerten Architekturanalyse verwendet wurde, wurde es auch mit 561-nm-Laseranregung und 405-nm-Laseraktivierung für 20.000–120.000 Bilder abgebildet.

Die Bildrekonstruktion wurde mit PeakSelector (G. Shtengel und H. Hess, Howard Hughes Medical Institute, https://github.com/gleb-shtengel/PeakSelector) wie zuvor beschrieben durchgeführt26. In das Deckglas eingebettete Goldnanopartikel wurden als Referenzmarkierungen verwendet, um überlagerte Bilder zu kalibrieren, auszurichten und in ein einziges 3D-Bild umzuwandeln. Lokalisierungen mit einer geschätzten x/y-Unsicherheit von mehr als 0,06 Pixel (oder Nanometeräquivalent) wurden aus den Daten herausgefiltert. Es wurden nur Lokalisierungen einbezogen, die weniger als 150 nm von den Passermarken des Deckglases entfernt waren, um diejenigen zu isolieren, die an oder in der Nähe der Plasmamembran gefunden wurden. Lokalisierungen wurden aus PeakSelector als ASCII-Datei exportiert und die gesamten Lokalisierungsrohdaten wurden als TIFF-Datei exportiert. Eine benutzerdefinierte MATLAB-Software wurde verwendet, um Referenzkügelchenlokalisierungen zu entfernen, indem Kügelchen im gesamten Rohdatenbild identifiziert und entsprechende Kügelchenlokalisationen in der ASCII-Datei eliminiert wurden (Extended Data, Abb. 4b).

Eine summierte Z-Projektion vorverarbeiteter Lokalisierungen wurde in PeakSelector mit Standardeinstellungen mit 3 nm pro Pixel gerendert und als TIFF-Datei gespeichert. Das gerenderte Bild und eine ASCII-Datei mit vorverarbeiteten Lokalisierungen wurden in MATLAB geladen und mögliche dreifach markierte PIEZO1-Moleküle wurden identifiziert und segmentiert. Zunächst wurden Spitzen im gerenderten Bild gefunden, indem zunächst die Daten mit einem Bandpass gefiltert wurden und der Algorithmus von Crocker und Grier67 zur Identifizierung von Spitzen verwendet wurde. Als nächstes wurden die Peaks einer Analyse des nächsten Nachbarn unterzogen, wobei jede Fluorophorposition zwei Nachbarn haben musste, dass ihre Mittelpositionen mehr als 9 und weniger als 60 nm voneinander entfernt sein mussten und dass jeder Peak im Cluster mehr als 60 nm von jedem anderen entfernt sein musste Lokalisierungen. Jedes gerenderte PIEZO1-Kandidatenmolekül wurde dann mit den entsprechenden Lokalisierungen verbunden und die Lokalisierungen wurden in einzelne Partikel segmentiert (Extended Data Abb. 4c). Durch die Verwendung einer summierten Z-Projektion ist dieser Ansatz auf die Segmentierung in der x-y-Ebene beschränkt. Um nicht assoziierte Lokalisierungen in z zu entfernen, wurden alle Lokalisierungen, die mehr als 75 nm vom Partikelmittelwert entfernt waren, von jedem Partikel entfernt.

Jedes segmentierte Partikel wurde anschließend von Heydarian et al.28 in den vorlagenfreien Einzelpartikel-Mittelungsworkflow eingespeist. Kurz gesagt wurde der Scale-Sweep-Ansatz verwendet, um einen optimalen Skalenparameter von 5 nm für den Gesamtregistrierungsprozess zwischen segmentierten Partikeln zu bestimmen. Für fünf Iterationen der Lie-Algebra-Konsistenzprüfung wurde ein Schwellenwert von 1 verwendet, mit dem eine datengesteuerte Vorlage erstellt und ein erster Satz ausgerichteter Partikel erstellt wurde. Ein zusätzlicher Verarbeitungsschritt wurde hinzugefügt, um diese anfänglich ausgerichteten Partikel in die x-y-Ebene zu drehen, bevor eine dreifache Symmetrie gefördert wurde, indem jedes anfänglich ausgerichtete Partikel um einen zufälligen ganzzahligen Faktor von 2 × π/3 gedreht wurde. Diese symmetriegeförderten Partikel wurden dann verwendet, um in einem Bootstrapping-Schritt ein endgültiges Superpartikel zu erzeugen, bei dem jedes Partikel mit der datengesteuerten Vorlage verglichen wurde.

Superteilchen (Abb. 1c, d und 2c und erweiterte Daten Abb. 5) wurden durch Berechnen einer Kerndichteschätzung für das endgültige Superteilchen unter Verwendung der MATLAB-Funktion mvksdensity und einer Bandbreite von 2,5 nm visualisiert. Lokalisierungen im Partikel wurden mit Größe und Farbe proportional zu ihrer lokalen Dichte aufgezeichnet.

Runde Glasdeckgläser Nr. 1,5 (Warner Instruments) mit einem Durchmesser von 18 mm wurden durch Kochen in 1 % Hellmanex III-Reinigungsmittel (Hellma GmbH) in MilliQ-Wasser und 10-minütige Ultraschallbehandlung in einem Wasserbad gereinigt. Die Deckgläser wurden fünfmal in MilliQ-Wasser gewaschen, 10 Minuten lang in 1 M KOH beschallt und dann erneut in MilliQ-Wasser gewaschen. Die Deckgläser wurden in 100 % Ethanol ausgetauscht und abgedeckt bis zu 1 Woche bei Raumtemperatur gelagert.

Vor dem Ausplattieren wurden die Deckgläser mit einem Strom gereinigter Luft getrocknet. Von den 0,3 × 106 Zellen pro ml Zellsuspension in Expi293-Medium wurden 207 µl auf die Deckgläser ausplattiert und 15 Minuten lang bei 37 °C in einem Zellkulturinkubator an der Glasoberfläche haften gelassen. Die Zellen wurden wie bei der iPALM-Bildgebung gewaschen und fixiert.

Für GsMTx-4-Experimente wurden die plattierten Zellen in 1 × HBSS gewaschen und dann mit 20 µM GsMTx-4 (Abcam) 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde vollständig entfernt und Fixiermittel (vorgewärmtes 37 °C 1x HBSS mit 0,8 % PFA und 0,1 % Glutaraldehyd) sofort, aber vorsichtig zugegeben. Man ließ die Zellen 10 Minuten lang fixieren und wusch sie in HBSS.

Für die Anreicherung der Plasmamembran mit Margarinsäure wurde die Anreicherung im Wesentlichen wie zuvor beschrieben durchgeführt45. Kurz gesagt, eine frische Ampulle Margarinsäure (Nu-Chek Prep) wurde in DMSO auf 150 mM gelöst. Margarinsäure-Stammlösung wurde dem erwärmten Expi293-Medium in einer Endkonzentration von 300 µM zugesetzt. Das Medium wurde abwechselnd gewirbelt, beschallt und bei 37 °C inkubiert, bis es vollständig aufgelöst war. Sechs Stunden nach der Transfektion wurde das Medium gegen das mit Margarinsäure angereicherte Medium ausgetauscht. Die Zellen wurden weitere 18 Stunden lang kultiviert, bevor sie für die Bildgebung vorbereitet wurden.

Für Yoda1-Experimente wurde eine Stammlösung von 10 mM Yoda1 (Tocris) in DMSO zu vorgewärmtem 37 °C 1× HBSS bis zu einer Endkonzentration von 50 µM gegeben. Die Lösung wurde 45 s lang bei voller Geschwindigkeit verwirbelt, um Yoda1 vollständig aufzulösen. Die Zellen wurden in 1× HBSS gewaschen und Yoda1 sofort hinzugefügt. Die Zellen wurden 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Als nächstes wurde die Lösung entfernt und sofort, aber vorsichtig, Fixiermittel (vorgewärmtes 37 °C 1× HBSS mit 0,8 % PFA und 0,1 % Glutaraldehyd) mit 50 µM Yoda1 zugegeben. Man ließ die Zellen 10 Minuten lang fixieren und wusch sie in HBSS.

Für osmotische Quellexperimente wurden die ausplattierten Zellen in 1× HBSS gewaschen und dann 2,5 Minuten lang einer 120 mOsm modifizierten Ringer-Lösung (48,8 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,40) und 10 mM d-Glucose) ausgesetzt bei Raumtemperatur. Als nächstes wurden die Zellen vorsichtig in ein hypotonisches Fixiermittel (120 mOsm modifizierter Ringer, 0,8 % PFA und 0,1 % Glutaraldehyd) ausgetauscht. Man ließ die Zellen 10 Minuten lang fixieren und wusch sie ausgiebig in 120 mOsm modifizierter Ringer-Lösung. Die Osmolalität aller Lösungen wurde mit einem Dampfdruckosmometer auf ±5 mOsm bestimmt.

Nach dem Fixieren und Waschen wurden 150-nm-Gold-Nanosphären-Referenzmarken (BBI Solutions) auf das Deckglas aufgetragen und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Deckglas wurde dann in HBSS gewaschen.

Zur Bildgebung wurden die Zellen wie bei iPALM in den isotonischen Bildgebungspuffer ausgetauscht, außer mit 20 mM Cysteamin. Das Deckglas wurde auf einen Glasobjektträger gelegt, der eine mit Bildpuffer gefüllte Hohlraumvertiefung (Globe Scientific) enthielt, und nach unten gedrückt, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Das Deckglas wurde dann mit Elite Double 22 Dentalepoxidharz (Zhermack) auf dem Objektträger versiegelt.

Um durch Detergens gelöstes PIEZO1-Protein der Maus zu erhalten, wurden Expi293-Zellen mit mPIEZO1-N-Tandem-HisTag-TAG103-C-HaloTag-TwinStrep mit pNEU-hMbPylRS-4×U6M15 in einer 30-ml-Kultur mit 500 µM TCO*K transfiziert. Nach 12–16 Stunden wurden die Zellen mit 7 ml Expi293-Medium gefüttert und Natriumbutyrat bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Nach 48 Stunden wurden die Zellen pelletiert und in frischem Expi293-Medium resuspendiert und eine weitere Stunde lang kultiviert, damit überschüssiges TCO*K aus den Zellen diffundieren konnte. Die Zellen wurden dann durch Pelletieren bei 100 g und zweimaliges Resuspendieren in eiskaltem 1× HBSS, das 1× HALT-Proteaseinhibitor (Thermo Fisher) enthielt, gewaschen. Die Zellen wurden ein letztes Mal bei 1.000 g pelletiert, der Überstand entfernt und das Zellpellet in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Zur Affinitätsreinigung des Proteins wurden gefrorene Zellpellets direkt in eiskaltem Solubilisierungspuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 1 % C12E9 und 1 × HALT-Proteaseinhibitor) resuspendiert. Die Mischung wurde 1 Stunde lang bei 4 °C übereinander rotiert, um Membranproteine ​​zu solubilisieren, und 30 Minuten lang bei 4 °C mit 45.000 g zentrifugiert, um nichtlösliche Ablagerungen und Aggregate zu pelletieren. Der Überstand wurde auf eine Säule geladen, die 1 ml abgesetztes TALON-Metallaffinitätsharz, vorgewaschen mit Waschpuffer (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 % C12E9 und 1 × HALT-Proteaseinhibitor) und das His-markierte PIEZO1 enthielt Protein konnte binden. Nach dem Waschen des Harzes mit 30 ml Waschpuffer wurde die Säule verschlossen und 300 µl Waschpuffer mit 4 µM Tetrazin – Alexa Fluor 647 hinzugefügt. Das Harzbett wurde resuspendiert und 10 Minuten lang bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert. Das Harz wurde ausgiebig in Waschpuffer ohne Proteaseinhibitor gewaschen. Das Protein wurde in 25 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 % C12E9 und 200 mM Imidazol eluiert. Das Eluat wurde dann direkt auf eine Säule geladen, die 1 ml mit Waschpuffer vorgewaschenes Streptactin-Sepharose-Harz enthielt. Nach der Bindung wurde das Harz mit 30 ml Waschpuffer gewaschen und in Waschpuffer mit 25 mM Biotin eluiert. Das Eluat wurde auf einer Amicon 50-kDa-Molekulargewichts-Cut-off-Säule bei 5.000 g konzentriert und zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurde das Protein unter Verwendung von zwei mit Waschpuffer voräquilibrierten Zeba-Entsalzungssäulen mit einem Molekulargewichts-Cut-Off von 40 kDa gepuffert. Die Proteinkonzentration wurde mit A280 auf einem Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert, in Aliquots aufgeteilt, auf flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –80 °C gelagert.

Es wurden 1,5 Glasdeckgläser mit einer Größe von 22 × 22 mm gekauft, die mit einer spärlich biotinylierten PEG-Bürste vorfunktionalisiert waren (Microsurfaces). Aufgrund der Beschichtungsdichte beträgt der durchschnittliche Abstand zwischen Biotinen auf der Bürstenoberfläche etwa 112 nm, was ungefähr dem gleichen Grenzabstand entspricht, den der Clustering-Algorithmus zur Identifizierung dreifach markierter PIEZOs verwendet. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Zunächst wurden die Deckgläser 20 Minuten lang mit unverdünnten 150-nm-Gold-Nanosphären-Referenzmarken (BBI-Lösungen) inkubiert. Diese Gold-Nanokugeln hefteten sich spärlich an Unvollkommenheiten in der PEG-Bürstenoberfläche, aber dicht genug, dass mindestens zwei Gold-Referenzpunkte im Sichtfeld zur Stabilisierung auf dem MINFLUX-Mikroskop gefunden werden konnten. Die Deckgläser wurden dann gut mit Immobilisierungspuffer (25 mM HEPES (pH 8,0), 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,1 % C12E9 und 1 % Roche-Blockierungsreagenz) gewaschen und in diesem Puffer 15 Minuten lang inkubiert, um alle nicht passivierten Stellen zu blockieren. Als nächstes wurde nicht-funktionalisiertes Streptactin-XT (IBA Lifesciences) in Immobilisierungspuffer auf 100 nM verdünnt, 7 Minuten lang bei Raumtemperatur zum Deckglas gegeben, um an den Biotinen auf der PEG-Bürste zu haften, und die Deckgläser wurden gut mit Immobilisierungspuffer gewaschen um überschüssiges Streptactin-XT zu entfernen. Schockgefrorenes Protein wurde auf Eis aufgetaut, in Immobilisierungspuffer auf 20 nM verdünnt und auf das Deckglas aufgetragen. Strep-markiertes PIEZO1 konnte 10 Minuten lang an das immobilisierte Streptactin-XT binden und das Deckglas wurde erneut gründlich in Immobilisierungspuffer gewaschen. Das Protein wurde dann in Immobilisierungspuffer ausgetauscht und damit gewaschen, der das Detergens GDN ohne Roche-Blockierungsreagenz (25 mM HEPES (pH 8,0), 150 mM NaCl, 2 mM DTT und 0,02 % GDN) enthielt.

Das beschichtete Deckglas wurde auf einen Glasobjektträger gelegt, der eine Hohlraumvertiefung (Globe Scientific) enthielt, die mit Bildgebungspuffer (50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 % Glucose, 0,02 % GDN, 20 mM Cysteamin, 40 µg) gefüllt war ml-1 Katalase aus Rinderleber und 100 µg ml-1 Glucoseoxidase aus A. niger, Typ VII) und nach unten gedrückt, um überschüssigen Puffer zu entfernen. Das Deckglas wurde dann mit Elite Double 22 Dentalepoxidharz (Zhermack) auf dem Objektträger versiegelt und auf dem MINFLUX-Mikroskop montiert. Die Bildgebung wurde wie oben beschrieben durchgeführt.

Alle MINFLUX-Daten wurden mit einem kommerziellen MINFLUX 3D-Mikroskop unter Verwendung der Imspector-Software mit MINFLUX-Treibern (Abberior Instruments) erfasst. Zur Stabilisierung wurde ein Sichtfeld mit drei oder mehr Goldmarken gewählt. Ein aktives Stabilisierungssystem, das Nahinfrarotstreuung von Gold-Referenzmarken und eine aktive Rückkopplungskorrektur nutzt, wurde verwendet, um einen ausgewählten räumlichen Sollwert festzulegen. Es wurde sichergestellt, dass die mittlere Standardabweichung der gemessenen Probenposition relativ zum von der MINFLUX-Schnittstellensoftware festgelegten Stabilisierungssollwert in jeder Achse weniger als 3 nm betrug32. Für die MINFLUX-Bildgebung wurde ein Sichtfeld von 25–225 µm2 am Boden der Zelle gewählt. Mehr als 50 % der sichtbaren Fluorophore im Sichtfeld wurden durch iterative konfokale Scans mit dem 640-nm-Laser bei 2–4 % Leistung in einen dunklen Zustand versetzt. Die Probe wurde mit 6 % 640-nm-Laserleistung abgebildet, die im Verlauf der Bildgebungssitzung manuell auf 9 % erhöht wurde. Anschließend wurde die 405-nm-Laserleistung im Laufe mehrerer Stunden langsam von 0 auf 12–18 % gesteigert. Die Proben wurden insgesamt 12–48 Stunden lang abgebildet. Für jede Erkrankung wurden mindestens drei separate biologische und experimentelle Replikate abgebildet. Es wurde gemessen, dass der 640-nm-Anregungslaser etwa 4,30 µW pro Prozent eingestellter Leistung auf der Probenebene aufweist, und ein 405-nm-Aktivierungslaser wurde mit etwa 16 nW pro Prozent eingestellter Leistung auf der Probenebene gemessen. Beachten Sie, dass während der MINFLUX-Zielroutine die Laserleistung in der letzten Iteration auf den Faktor sechs erhöht wird32.

Rohe endgültige gültige Lokalisierungen aus den letzten Targeting-Iterationen wurden direkt aus der MINFLUX Imspector-Schnittstelle als .mat-Datei exportiert. Anschließend wurde eine benutzerdefinierte MATLAB-Analysesoftware verwendet, um Cluster von drei Lokalisierungen zu identifizieren und zu trennen. Um möglichst konsistent und unvoreingenommen zu sein, wurden alle Daten bis auf einen Sonderfall (siehe unten) mit denselben Parametern analysiert. Zunächst wurden die Daten gefiltert, um Spuren mit einer Standardabweichung von mehr als 10 nm und mehr als drei Lokalisierungen pro Spur zu entfernen. Dieser Schritt entfernte Lokalisierungen vom Hintergrund und große Streifen, die wahrscheinlich auf diffundierende fluoreszierende Moleküle zurückzuführen waren, die sich durch die Bildebene bewegten. Als nächstes wurden die Lokalisierungen einem dichtebasierten Clustering-Algorithmus unterzogen, im Wesentlichen wie zuvor beschrieben33. Dieser Algorithmus verwendet zweistufiges DBSCAN-Clustering (dbscan2 in MATLAB), gefolgt von einem Erwartungsmaximierungs-GMM, um der Position von Fluorophoren 3D-Lokalisierungen zuzuordnen. Hier hatte der erste DBSCAN-Schritt ein Epsilon von 30 nm und erforderte fünf Nachbarn für einen Kernpunkt (minpts = 5). Der zweite DBSCAN-Schritt hatte ein Epsilon von 6–7 nm, abhängig von der Menge an Rauschen in den Daten, und minpts = 5. Das anfängliche GMM-Fit-Sigma wurde auf 5 nm eingestellt. Die Positionen der Fluorophorzentren wurden als Mittelwerte der GMM-Anpassung geschätzt.

Jede identifizierte Fluorophorposition wurde dann sowohl einem separaten DBSCAN-Clustering als auch einem Analyseschritt für den nächsten Nachbarn unterzogen. Der DBSCAN-Schritt identifizierte Cluster von drei Fluorophorpositionen mit Epsilon = 100 nm und Minpts = 3. Der Nächste-Nachbarn-Schritt erforderte, dass jede Fluorophorposition zwei Nachbarn haben musste und ihre Mittelpositionen zwischen 6 und 50 nm voneinander entfernt sein mussten. In einem Sonderfall wurde für Abb. 4b die nächste Nachbarstufe so angepasst, dass sie einen minimalen und maximalen Abstand zwischen 5 und 60 nm aufweist, um Abstände zwischen den Schaufeln zu erfassen, die etwas länger als 50 nm waren. Beachten Sie, dass der wahrscheinlichste Abstand zwischen den Rotorblättern, gemessen an Position 103 in einer Zelle, derselbe ist wie für den maximalen Abstand zum nächsten Nachbarn von 50 nm (Abb. 2e und 4b). Als nächstes wurden Cluster von drei Fluorophorpositionen, die beide Schritte durchlaufen, segmentiert. Die Daten wurden manuell z-gefiltert, basierend auf der Verteilung der Rohlokalisierungen, um nur plasmamembrangebundene PIEZO-Moleküle zu isolieren. Schließlich wurden Kandidatencluster mit Zwischenblattwinkeln von mehr als 120° herausgefiltert, um unspezifische Spurenstreifen zu eliminieren. Für jeden identifizierten Cluster aus drei Molekülen wurde der durchschnittliche Abstand zwischen den Klingen direkt aus den Positionen der Fluorophorzentren berechnet.

Zunächst wurden die Sequenzpositionen der PIEZO-Wiederholungsdomänen5 aus den Aminosäuresequenzen PIEZO1 (Uniprot-Eintrag Q8CD54) und PIEZO2 (Uniprot-Eintrag EJ2F22) isoliert. Die Transmembrandomänen wurden anhand der Strukturen als Orientierungshilfe identifiziert und in verschiedene Ketten aufgeteilt (Ergänzungstext). Die Inter-PIEZO-Wiederholungsbindungsenergie wurde mit dem PDBePISA-Tool43 berechnet. Der gesamte Gewinn an freier Solvatationsenergie bei der Bildung der Schnittstelle −ΔG wurde für jede Bindungsschnittstelle bestimmt, die jede PIEZO-Wiederholungsdomäne mit und ohne den Beitrag extrazellulärer Schleifen kontaktiert.

Strukturmodelle aus Kryo-EM wurden von der Protein Data Bank (PDB) bezogen, und die PDB-Zugangsnummern sind im Artikel vermerkt. Um ein trimeres AlphaFold II-Modell zu erstellen, wurde die Vorhersage des Monomers E2JF22 auf die drei PIEZO1-Untereinheiten von PDB 6B3R überlagert. Aufgrund der mangelnden Zuverlässigkeit der Kappenplatzierung im Vergleich zu den PIEZO-Blättern im AlphaFold-Modell wurde der CED entfernt und nicht in die Strukturanalysen einbezogen.

Die Zellen wurden genau wie für die MINFLUX-Bildgebung vorbereitet, mit der Ausnahme, dass 1 µM des zelldurchdringenden Janelia Fluor 549-Halo-Liganden (Promega) zum Tetrazin-Alexa Fluor 647-Markierungsmix hinzugefügt wurde. Alle Bilder (Extended Data Abb. 2b) wurden mit einem konfokalen Nikon AX-Mikroskop mit der NIS Elements-Software und den Bildeinstellungen (Laserleistung, Verstärkung, Auflösung, Pixelverweilzeit, Ölimmersionsplan-Apochromatobjektiv ×60 1,4 NA und Pixeldimensionseinstellungen) aufgenommen ) wurden für alle Bedingungen gleich gehalten. Bei allen Bildern wurden die Helligkeits- und Kontrastanpassungen einheitlich auf das gesamte Bild angewendet.

Zur Überprüfung der ordnungsgemäßen Funktion markierter Proteine ​​wurden TAG-substituierte PIEZO1-Konstrukte und pNEU-hMbPylRS-4×U6M15 im Verhältnis 1:1 in Gegenwart von 250 µM TCO*K mit Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) in Piezo1 transfiziert. Knockout-HEK293-Zellen (CRL-3519, American Type Culture Collection), plattiert auf Poly-D-Lysin-beschichtete Deckgläser. Für Wildtyp-Kontrollexperimente wurde mPIEZO1-IRES-eGFP (Plasmid #80925, Addgene) mit pNEU-hMbPylRS-4×U6M15 im Verhältnis 1:1 co-transfiziert. Die Zellen wurden gemäß den Richtlinien der American Type Culture Collection kultiviert und mit dem MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza) auf Mykoplasmenfreiheit überprüft. Vor der Aufzeichnung durften die Zellen 24–48 Stunden lang exprimieren.

Für Experimente, bei denen die Zellen markiert wurden, wurden die Zellen zunächst mit DMEM und 20 mM HEPES gewaschen. Die gesamte Markierung wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Als nächstes wurden die Zellen in DMEM, 20 mM HEPES und 1 mg ml-1 Roche-Blockierungsreagenz für 5 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Nach der Blockierung wurden die Zellen 10 Minuten lang mit DMEM, 20 mM HEPES, 1 mg ml-1 Roche-Blockierungsreagenz und 4 µM Tetrazin-Alexa Fluor 647 markiert. Die Zellen wurden dann in DMEM, 20 mM HEPES und 1 mg ml-1 Roche-Blockierungsreagenz gewaschen und in DMEM und 20 mM HEPES ausgetauscht. Die Markierung wurde durch Visualisierung auf einem Fluoreszenzmikroskop bestätigt.

Mechanisch aktivierte Ströme von HEK293 Piezo1-Knockout-Zellen wurden im Whole-Cell-Voltage-Clamp-Modus mit einem MultiClamp700A-Verstärker und DigiData1550 (Molecular Devices) aufgezeichnet und mit der pClamp-Software (Version 10.7) direkt gespeichert und online digitalisiert. Ströme wurden bei –80 mV aufgezeichnet, bei 20 kHz abgetastet und bei 2 kHz gefiltert. Aufzeichnungselektroden hatten einen Widerstand von 1,5–3 MΩ, wenn sie mit intrazellulärer Lösung auf CsCl-Basis gefüllt waren: 133 mM CsCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,3 mit CsOH), 5 mM EGTA, 4 mM Mg-ATP und 0,4 mM Na-GTP. Die extrazelluläre Badlösung bestand aus 133 mM NaCl, 3 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,3 mit NaOH) und 10 mM Glucose. Die mechanische Stimulation wurde mit einer feuerpolierten Glaspipette (Spitzendurchmesser 3–4 µm) erreicht, die in einem Winkel von 80° relativ zur aufzuzeichnenden Zelle und etwa 5 µm von der Zelle entfernt positioniert war. Die Verschiebung der Sonde in Richtung Zelle wurde durch einen Clampex-gesteuerten piezoelektrischen Kristall-Mikrotisch (E625 LVPZT Controller/Amplifier, Physik Instrumente) gesteuert. Die Sonde hatte während der Rampenphase des Befehls zur Vorwärtsbewegung eine Geschwindigkeit von 1 µm ms−1 und der Reiz wurde für eine Dauer von 125 ms angelegt. Für jede Zelle wurde alle 10 s eine Reihe mechanischer Schritte in Schritten von 1 µm angewendet, beginnend mit einer anfänglichen Verschiebung von 5 µm. Der Schritt, bei dem die Sondenspitze die Zelle sichtbar berührte, wurde als Basislinie für die Bestimmung des scheinbaren Schwellenwerts verwendet (der Mikrometer über der Berührung der Zelle, bei dem die erste Reaktion beobachtet wurde).

Eine Familie von Verschiebungsschritten (0,5-µm-Schritte) wurde auf die Zelle angewendet und mechanisch aktivierte Ströme wurden normalerweise bis zu 2–3 µm über der Schwellenreaktion aufgezeichnet, um einen Verlust der Zelle zu vermeiden. Yoda1 wurde aus einer 20 mM Stammlösung in DMSO verdünnt, stark gevortext und innerhalb von 5 Minuten verwendet, um einen Niederschlag in der Lösung zu vermeiden. Yoda1 (10 µM) wurde manuell ohne Badperfusion aufgetragen und die Zellen wurden 5 Minuten lang exponiert und anschließend ausgewaschen. Familien mechanisch aktivierter Ströme wurden zweimal vor Yoda1, zwei- bis dreimal in Yoda1 und mehrmals während des Auswaschens erfasst.

Für Yoda1 und die hypotonische Elektrophysiologie wurden Swell1-Knockout-HEK293F-Zellen68 in FreeStyle 293-Medium kultiviert und wie die Expi293-Zellen gepflegt. Mit dem MycoAlert Mycoplasma Detection Kit (Lonza) wurde bestätigt, dass die Zellen frei von Mykoplasmen waren. Die Zellen wurden mit mPIEZO1-IRES-eGFP (Plasmid Nr. 80925, Addgene) unter Verwendung des EndoFectin 293-Transfektionsreagenzes (GeneCopeia) in einer Konzentration von 1 µg ml–1 transfiziert. Man ließ die Zellen 48 Stunden lang exprimieren und plattierte sie vor der Aufzeichnung auf mit Poly-D-Lysin beschichtete Glasdeckgläser.

Ganzzellströme wurden mit einem Axopatch 200B-Verstärker und Digidata 1440A (Molecular Devices) aufgezeichnet und mit pClamp (Version 10.2) analysiert. Ströme wurden bei +80 mV aufgezeichnet, bei 20 kHz abgetastet und bei 2 kHz gefiltert. Die Aufzeichnungselektroden wurden gezogen und auf einen Anfangswiderstand von 4–8 MΩ poliert, wenn sie mit einer Pipettenlösung gefüllt waren, die Folgendes enthielt: 110 mM CsCl, 40 mM CsF, 10 mM EGTA und 20 mM HEPES (pH 7,4).

Für Yoda1-Experimente enthielt die Badlösung Folgendes: 140 mM NaCl, 2,4 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,4), 10 mM D-Glucose, 4 mM MgCl2 und 4 mM CaCl2 (307 ± 5 mOsm). Reaktionen wurden mit 50 µM Yoda1, zubereitet in einer Badlösung, hervorgerufen.

Für osmotische Quellexperimente enthielt die Badlösung 40 mM NaCl, 2,4 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,4), 10 mM d-Glucose, 4 mM MgCl2, 4 mM CaCl2 und 185 mM d-Mannitol (310 mOsm ± 5 mOsm). ). Reaktionen wurden mit einer hypotonischen Badlösung hervorgerufen, die 40 mM NaCl, 2,4 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7,4), 10 mM d-Glucose, 4 mM MgCl2 und 4 mM CaCl2 (122 ± 5 mOsm) enthielt. Die Osmolalität aller Lösungen wurde mit einem Dampfdruckosmometer (Wescor) gemessen.

Die Daten wurden visualisiert und statistische Tests wurden in der Software MATLAB (MathWorks) und Prism (GraphPad) durchgeführt. Molekülstrukturen wurden in der Software MolStar Viewer (https://molstar.org/viewer/) und Chimera (UCSF) visualisiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle Daten, die den Artikel unterstützen, einschließlich der Rohdaten der MINFLUX-Analyse für jede Versuchsbedingung, werden als Quelldaten bereitgestellt. Proteinstrukturen wurden aus der RCSB-Proteindatenbank (PIEZO1 6B3R, PIEZO1 7WLU und PIEZO2 6KG7) und der AlphaFold-Proteinstrukturdatenbank (PIEZO1 E2JF22) erhalten. Rohdaten und alle nicht kommerziell erhältlichen Reagenzien sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Code für die iPALM-Datenvorverarbeitung wurde bereits veröffentlicht26 und ist unter https://github.com/gleb-shtengel/PeakSelector verfügbar. Der benutzerdefinierte MATLAB-Code für die iPALM-Datenanalyse ist unter https://doi.org/10.5281/zenodo.8017632 verfügbar. Der benutzerdefinierte MATLAB-Code für die MINFLUX-Analyse ist unter https://github.com/PatapoutianLab/MINFLUX_Piezo_Analysis verfügbar.

Coste, B. et al. Piezo1 und Piezo2 sind wesentliche Bestandteile verschiedener mechanisch aktivierter Kationenkanäle. Wissenschaft 330, 55–60 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Coste, B. et al. Piezoproteine ​​sind porenbildende Untereinheiten mechanisch aktivierter Kanäle. Natur 483, 176–181 (2012).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J., Lewis, AH & Grandl, J. Berührung, Spannung und Transduktion – die Funktion und Regulierung von Piezo-Ionenkanälen. Trends Biochem. Wissenschaft. 42, 57–71 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Guo, YR & MacKinnon, R. Strukturbasierter Membrankuppelmechanismus für Piezo-Mechanosensitivität. eLife https://doi.org/10.7554/eLife.33660 (2017).

Saotome, K. et al. Struktur des mechanisch aktivierten Ionenkanals Piezo1. Natur 554, 481–486 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Wang, Y. et al. Ein hebelartiger Transduktionsweg für die chemische und mechanische Steuerung des mechanoempfindlichen Piezo1-Kanals über große Entfernungen. Nat. Komm. 9, 1300 (2018).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, Q. et al. Struktur und Mechanismus des Piezo1-Kanals. Natur 554, 487–492 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Lin, YC et al. Kraftinduzierte Konformationsänderungen in PIEZO1. Natur 573, 230–234 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kefauver, JM, Ward, AB & Patapoutian, A. Entdeckungen in Struktur und Physiologie mechanisch aktivierter Ionenkanäle. Natur 587, 567–576 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sukharev, S. & Corey, DP Mechanosensitive Kanäle: Vielfalt von Familien und Gating-Paradigmen. Wissenschaft. STKE 2004, re4 (2004).

Artikel PubMed Google Scholar

Ranade, SS et al. Piezo2 ist der wichtigste Wandler mechanischer Kräfte für die Berührungsempfindung bei Mäusen. Natur 516, 121–125 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zeng, WZ et al. PIEZOs vermitteln die neuronale Wahrnehmung des Blutdrucks und den Barorezeptorreflex. Wissenschaft 362, 464–467 (2018).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, J. et al. Piezo1-Integration der Gefäßarchitektur mit physiologischer Kraft. Natur 515, 279–282 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ranade, SS et al. Piezo1, ein mechanisch aktivierter Ionenkanal, ist für die Gefäßentwicklung bei Mäusen erforderlich. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 111, 10347–10352 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hill, RZ, Loud, MC, Dubin, AE, Peet, B. & Patapoutian, A. PIEZO1 wandelt mechanischen Juckreiz bei Mäusen um. Natur 607, 104–110 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cahalan, SM et al. Piezo1 verknüpft mechanische Kräfte mit dem Volumen der roten Blutkörperchen. eLife https://doi.org/10.7554/eLife.07370 (2015).

Wang, L. et al. Struktur und Mechanisierung des Tastkanals PIEZO2 bei Säugetieren. Natur 573, 225–229 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Haselwandter, CA, Guo, YR, Fu, Z. & MacKinnon, R. Elastische Eigenschaften und Form der Piezo-Kuppel, die ihrer mechanosensorischen Funktion zugrunde liegen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 119, e2208034119 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haselwandter, CA, Guo, YR, Fu, Z. & MacKinnon, R. Quantitative Vorhersage und Messung des Piezo-Membran-Fußabdrucks. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 119, e2208027119 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

De Vecchis, D., Beech, DJ & Kalli, AC Molekulardynamiksimulationen der Öffnung des Piezo1-Kanals durch Erhöhung der Membranspannung. Biophys. J. 120, 1510–1521 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Yang, X. et al. Strukturverformung und Krümmungserkennung von PIEZO1 in Lipidmembranen. Natur 604, 377–383 (2022).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Sahl, SJ, Hell, SW & Jakobs, S. Fluoreszenznanoskopie in der Zellbiologie. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 18, 685–701 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Serfling, R. et al. Designer-tRNAs für den effizienten Einbau nichtkanonischer Aminosäuren durch das Pyrrolysinsystem in Säugetierzellen. Nukleinsäuren Res. 46, 1–10 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jumper, J. et al. Hochpräzise Vorhersage der Proteinstruktur mit AlphaFold. Natur 596, 583–589 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mihaila, TS et al. Verbesserter Einbau von Subnanometer-Tags in zelluläre Proteine ​​für die Fluoreszenz-Nanoskopie durch optimierte Erweiterung des genetischen Codes. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 119, e2201861119 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shtengel, G. et al. Interferometrische Fluoreszenz-Superauflösungsmikroskopie löst dreidimensionale zelluläre Ultrastruktur auf. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 106, 3125–3130 (2009).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, TI, Aaron, J., Chew, TL & Springer, TA Messung der Integrin-Konformationsänderung auf der Zelloberfläche mit hochauflösender Mikroskopie. Cell Rep. 22, 1903–1912 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heydarian, H. et al. 3D-Partikelmittelung und Nachweis makromolekularer Symmetrie in der Lokalisierungsmikroskopie. Nat. Komm. 12, 2847 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heydarian, H. et al. Templatefreie 2D-Partikelfusion in der Lokalisierungsmikroskopie. Nat. Methoden 15, 781–784 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Balzarotti, F. et al. Bildgebung und Verfolgung fluoreszierender Moleküle mit Nanometerauflösung und minimalen Photonenflüssen. Wissenschaft 355, 606–612 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Gwosch, KC et al. Die MINFLUX-Nanoskopie liefert eine mehrfarbige 3D-Nanometerauflösung in Zellen. Nat. Methoden 17, 217–224 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Schmidt, R. et al. MINFLUX 3D-Bildgebung im Nanometerbereich und Verfolgung im Mikrosekundenbereich auf einem herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop. Nat. Komm. 12, 1478 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pape, JK et al. Mehrfarbige 3D-MINFLUX-Nanoskopie mitochondrialer MICOS-Proteine. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 117, 20607–20614 (2020).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bagriantsev, SN, Gracheva, EO & Gallagher, PG Piezoproteine: Regulatoren der Mechanosensation und anderer zellulärer Prozesse. J. Biol. Chem. 289, 31673–31681 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suchyna, TM et al. Identifizierung eines Peptidtoxins aus dem Spinnengift von Grammostola spatulata, das kationenselektive dehnungsaktivierte Kanäle blockiert. J. Gen. Physiol. 115, 583–598 (2000).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bae, C., Sachs, F. & Gottlieb, PA Der mechanosensitive Ionenkanal Piezo1 wird durch das Peptid GsMTx4 gehemmt. Biochemistry 50, 6295–6300 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gnanasambandam, R. et al. GsMTx4: Mechanismus zur Hemmung mechanosensitiver Ionenkanäle. Biophys. J. 112, 31–45 (2017).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Miyamoto, T. et al. Funktionelle Rolle von Piezo1 beim durch Dehnung hervorgerufenen Ca2+-Einstrom und der ATP-Freisetzung in Urothelzellkulturen. J. Biol. Chem. 289, 16565–16575 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cox, CD et al. Die Entfernung des mechanoprotektiven Einflusses des Zytoskeletts zeigt, dass PIEZO1 durch die Spannung der Doppelschicht gesteuert wird. Nat. Komm. 7, 10366 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Syeda, R. et al. Piezo1-Kanäle sind von Natur aus mechanisch empfindlich. Cell Rep. 17, 1739–1746 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, S. & Thornton, JM Prinzipien der Protein-Protein-Wechselwirkungen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 93, 13–20 (1996).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tsai, CJ, Xu, D. & Nussinov, R. Strukturmotive an Protein-Protein-Grenzflächen: Proteinkerne versus Zwei-Zustands- und Drei-Zustands-Modellkomplexe. Proteinwissenschaft. 6, 1793–1805 (1997).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Krissinel, E. & Henrick, K. Rückschluss auf makromolekulare Anordnungen aus dem kristallinen Zustand. J. Mol. Biol. 372, 774–797 (2007).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Tyler, AII, Greenfield, JL, Seddon, JM, Brooks, NJ & Purushothaman, S. Kopplungsphasenverhalten fettsäurehaltiger Membranen an die Membranbiomechanik. Vorderseite. Zellentwickler. Biol. 7, 187 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Romero, LO et al. Nahrungsfettsäuren optimieren die mechanische Reaktion von Piezo1. Nat. Komm. 10, 1200 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dai, J., Sheetz, MP, Wan, X. & Morris, CE Membranspannung in schwellenden und schrumpfenden Weichtierneuronen. J. Neurosci. 18, 6681–6692 (1998).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Desplat, A. et al. Piezo1-Pannexin1-Komplexpaare erzwingen den Nachweis der ATP-Sekretion in Cholangiozyten. J. Gen. Physiol. https://doi.org/10.1085/jgp.202112871 (2021).

Andronic, J. et al. Hypotonische Aktivierung des Myo-Inositol-Transporters SLC5A3 in HEK293-Zellen, untersucht durch Zellvolumetrie, konfokale und hochauflösende Mikroskopie. PLoS ONE 10, e0119990 (2015).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Syeda, R. et al. LRRC8-Proteine ​​bilden volumenregulierte Anionenkanäle, die die Ionenstärke erfassen. Zelle 164, 499–511 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Qiu, Z. et al. SWELL1, ein Plasmamembranprotein, ist ein wesentlicher Bestandteil des volumenregulierten Anionenkanals. Zelle 157, 447–458 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J. et al. Die Inaktivierung mechanisch aktivierter Piezo1-Ionenkanäle wird durch die C-terminale extrazelluläre Domäne und die innere Porenhelix bestimmt. Cell Rep. 21, 2357–2366 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Syeda, R. et al. Chemische Aktivierung des Mechanotransduktionskanals Piezo1. eLife https://doi.org/10.7554/eLife.07369 (2015).

Botello-Smith, WM et al. Ein Mechanismus zur Aktivierung des mechanosensitiven Piezo1-Kanals durch das kleine Molekül Yoda1. Nat. Komm. 10, 4503 (2019).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wu, J., Goyal, R. & Grandl, J. Lokalisierte Kraftanwendung enthüllt mechanisch empfindliche Domänen von Piezo1. Nat. Komm. 7, 12939 (2016).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lewis, AH & Grandl, J. Piezo1-Ionenkanäle fungieren von Natur aus als unabhängige Mechanotransducer. eLife https://doi.org/10.7554/eLife.70988 (2021).

Tobin, M., Chaiyasitdhi, A., Michel, V., Michalski, N. & Martin, P. Steifheit und Spannungsgradienten des Tip-Link-Komplexes der Haarzelle in der Cochlea von Säugetieren. eLife https://doi.org/10.7554/eLife.43473 (2019).

Eatock, RA, Corey, DP & Hudspeth, AJ Anpassung der mechanoelektrischen Transduktion in Haarzellen des Sacculus des Ochsenfrosches. J. Neurosci. 7, 2821–2836 (1987).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hudspeth, AJ & Gillespie, PG Federn ziehen, um die Transduktion abzustimmen: Anpassung durch Haarzellen. Neuron 12, 1–9 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Mulhall, EM et al. Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zeigt die dynamische Stärke der Verbindung zwischen Haarzelle und Spitze. Nat. Komm. 12, 849 (2021).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Woo, SH et al. Piezo2 ist für die Mechanotransduktion von Merkelzellen erforderlich. Natur 509, 622–626 (2014).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, L. & Ginty, DD Die Struktur und Organisation lanzettlicher mechanosensorischer Komplexe an Maushaarfollikeln. eLife 3, e01901 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, S. et al. Dynamik des Kaliumkanal-Selektivitätsfilters durch Einzelmolekül-FRET. Nat. Chem. Biol. 15, 377–383 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, Y. et al. Einzelmoleküldynamik des Gatings in einem Neurotransmitter-Transporter-Homolog. Natur 465, 188–193 (2010).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, Y. et al. Einzelmolekül-FRET enthüllt Porengröße und Öffnungsmechanismus eines mechanosensitiven Ionenkanals. eLife 3, e01834 (2014).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ostersehlt, LM et al. DNA-PAINT MINFLUX Nanoskopie. Nat. Methoden 19, 1072–1075 (2022).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weber, M. et al. Die MINSTED-Nanoskopie dringt in den Angström-Lokalisierungsbereich vor. Nat. Biotechnologie. https://doi.org/10.1038/s41587-022-01519-4 (2022).

Otsu, N. Eine Schwellenwertauswahlmethode aus Graustufenhistogrammen. IEEE Trans. Syst. Mann Cybern. 9, 62–66 (1979).

Artikel Google Scholar

Crocker, JC & Grier, DG Methoden der digitalen Videomikroskopie für kolloidale Untersuchungen. J. Kolloidinterf. Wissenschaft. 179, 298–310 (1996).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Kefauver, JM et al. Struktur des menschlichen volumenregulierten Anionenkanals. eLife https://doi.org/10.7554/eLife.38461 (2018).

Referenzen herunterladen

Wir danken Y. Wang für die vorläufige Konzeptualisierung, C. Wurm, I. Jansen und Abberior Instruments für die Hilfe bei der MINFLUX-Erfassung und der Fehlerbehebung bei Instrumenten und/oder Software; S. Khuon für technische Unterstützung bei der iPALM-Probenvorbereitung; R. MacKinnon, C. Haselwandter und R. Hill für die kritische Lektüre des Manuskripts; S. Hell und J. Keller für die gemeinsame Nutzung des Clusteranalysecodes; und Mitglieder des Patapoutian-Labors für Feedback und Diskussionen. Die MINFLUX-Bildgebung wurde in der Scripps Research Core Microscopy Facility durchgeführt und von dieser unterstützt. Die iPALM-Bildgebung wurde am Advanced Imaging Center am Janelia Research Campus des Howard Hughes Medical Institute durchgeführt und von diesem unterstützt. Das Advanced Imaging Center am Janelia Research Campus wird vom Howard Hughes Medical Institute und der Gordon and Betty Moore Foundation unterstützt. Diese Arbeit wurde durch das NIH-Stipendium R01 HL143297 unterstützt. EMM wird durch ein Postdoktorandenstipendium der George E. Hewitt Foundation for Medical Research unterstützt. AP ist Forscher am Howard Hughes Medical Institute.

Kara L. Marshall

Aktuelle Adresse: Abteilung für Neurowissenschaften, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA

Howard Hughes Medical Institute, Abteilung für Neurowissenschaften, Dorris Neuroscience Center, Scripps Research, La Jolla, CA, USA

Eric M. Mulhall, Anant Gharpure, Adrienne E. Dubin, Kara L. Marshall und Ardem Patapoutian

Advanced Imaging Center, Howard Hughes Medical Institute Janelia Research Campus, Ashburn, VA, USA

Rachel M. Lee, Jesse S. Aaron, Michael A. Reiche und Teng-Leong Chew

Abteilung für Neurowissenschaften, Dorris Neuroscience Center, Scripps Research, La Jolla, CA, USA

Kathryn R. Spencer

Abteilung für Molekulare Medizin, Scripps Research, La Jolla, CA, USA

Scott C. Henderson

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EMM entwarf und führte alle biologischen und bildgebenden Experimente durch, analysierte alle Daten, schrieb den MINFLUX-Analysecode, schrieb das Manuskript und konzipierte zusammen mit AP das Projekt. RML schrieb den iPALM-Analysecode, analysierte die iPALM-Daten und führte die Superteilchenfusion durch. AG und AED führten die elektrophysiologischen Experimente durch. EMM und AG führten die Berechnungen der Bindungsenergie durch. JSA und MAR halfen bei der Vorbereitung der iPALM-Proben und führten die iPALM-Datenerfassung durch. KLM, KRS und JSA haben die iPALM-Daten vorverarbeitet und analysiert. SCH trug zu den MINFLUX-Bildgebungsexperimenten und zur Fehlerbehebung bei. T.-LC und AP trugen zum Projektdesign bei. AP betreute das Projekt. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und trugen zur Manuskriptbearbeitung bei.

Korrespondenz mit Ardem Patapoutian.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Alistair Curd und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Skalierte molekulare Darstellungen veröffentlichter Kryo-EM-Strukturen und Strukturmodelle. Jedes Protomer des PIEZO-Trimers ist blau, orange und grün gefärbt. b, Oben, gemessene Abstände zwischen den Klingen zwischen Aminosäureposition 103 in jedem Protomer von PIEZO1 für Modelle, die das letzte etwa ein Drittel der distalen Klinge auflösen. Die nächstgelegene äquivalente Aminosäureposition für PIEZO2 wurde als Isoleucin 79 bestimmt. Unten: gemessene Abstände zwischen den Klingen zwischen Aminosäureposition 670 in jedem Protomer von PIEZO1 aus allen in a gezeigten Strukturen. Die nächstgelegene äquivalente Aminosäureposition für PIEZO2 wurde als Lysin 775 bestimmt. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardabweichung dargestellt. Für alle Berechnungen gilt n = 1 PDB-Struktur.

Quelldaten

a, Übersicht über das Zellmarkierungs- und -plattierungsschema, das sowohl für die iPALM- als auch für die MINFLUX-Bildgebung verwendet wird. b: Zellen, die TCO*K-substituierte mPIEZO1-C-HaloTag-TwinStrep-Konstrukte exprimieren, wurden wie für die iPALM- und MINFLUX-Bildgebung (Methoden) live mit Tetrazin-AF647 markiert. Der zellpermeante JF549-HaloLigand wurde verwendet, um die intrazelluläre Seite des Kanals zu markieren. Die Markierung und Markierung an den Positionen 103 und 670 führte zu einer spezifischen Zelloberflächenmarkierung von PIEZO1. Die Markierung an Position 154 einer intrazellulären Schleife an einer Stelle, von der bekannt ist, dass sie die Funktion nicht stört69, führt zu einer Expression des Proteins auf der Zelloberfläche, wie durch JF549-HaloLigand-Markierung gezeigt, jedoch zu keiner Markierung mit dem zellimpermeanten Tetrazin-AF647. Maßstabsbalken = 20 µm. Repräsentative Bilder aus n = 20 Zellen.

a, links, schematische Darstellung der Elektrophysiologie ganzer Zellen mit Zellstich. Mittlere, maximale Ganzzellströme, hervorgerufen durch mechanische Stimulation. Die Zellen wurden mit mPIEZO1-IRES-eGFP (WT, graue Kreise, −1189 ± 280 pA, n = 9 Zellen), mPiezo1-TCO*K103-C-mEos3.2-TwinStrepTag (blaue Kreise, −1125 ± 262 pA, n = 11 Zellen) und mPiezo1-TCO*K103-C-HaloTag-TwinStrepTag (rote Kreise, −1259 ± 986 pA, n = 7 Zellen). Alle Zellen wurden mit der tRNA/Synthetase co-transfiziert und in Gegenwart der unnatürlichen Aminosäure TCO*K kultiviert. Rechts, Zeitkonstante der Inaktivierung für maximale Ganzzellströme in der Mitte (WT = 17 ± 3 ms, C-mEos3.2 = 14 ± 2 ms, C-HaloTag = 13 ± 2 ms). Alle Werte sind Mittelwerte ± Sem b, repräsentative Ganzzellströme, die durch mechanische Stimulation für TCO*K-markiertes mPIEZO1 mit und ohne tRNA/Synthetase hervorgerufen werden. c: Maximale Ganzzellströme, hervorgerufen durch mechanische Stimulation von mit Tetrazin-AF647 markierten Zellen unter den gleichen Bedingungen wie in a, für Zellen, die mit der tRNA/Synthetase co-transfiziert und in Gegenwart der nichtnatürlichen Aminosäure TCO*K kultiviert wurden. Die Markierung führt nicht zu einer signifikanten Änderung des maximalen Gesamtzellenstroms relativ zum WT-Kanal (WT = –727 ± 362 pA, n = 4 Zellen; C-mEos3.2 = –480 ± 128 pA, n = 6 Zellen; C -HaloTag = −383 ± 108 pA, n = 11 Zellen). Alle Werte sind Mittelwerte ± Standardabweichung, Yoda1-induzierte Verlangsamung der Kanalinaktivierung. Die Zeitkonstante der Inaktivierung wurde vor, während und nach der Badanwendung von 10 µM Yoda1 gemessen. Es werden Linien angezeigt, die Messungen einzelner Zellen verbinden. e, Quantifizierung der Yoda1-induzierten Verlangsamung der Inaktivierung für jedes der drei getesteten Konstrukte. Die mittlere Faltungsänderung bei der Inaktivierung wird als schwarze Linie angezeigt (WT = 2,8, n = 3 Zellen; C-mEos3.2 = 4,0, n = 3 Zellen; C-HaloTag = 2,9, n = 4 Zellen).

Quelldaten

a, Arbeitsablauf der iPALM-Datenverarbeitung, Partikelsegmentierung und Superpartikelfusion. b, Repräsentative Bilder (aus n = 5 Zellen), die die Entfernung von Kügelchen und die mögliche dreifach markierte PIEZO1-Segmentierung auf vorverarbeiteten Lokalisierungen zeigen, die mit dem 640-nm-Laser erfasst wurden. Oben links: vorverarbeitete Lokalisierungen an/in der Nähe der Plasmamembran, gerendert mit 4 nm pro Pixel. Oben in der Mitte ein Bild der gesamten gesammelten Photonen-Rohdaten. Die goldenen Passerperlen sind als helle Punkte erkennbar, da sie in jedem Bildrahmen ständig Photonen aussenden. Oben rechts: Referenzgoldkügelchen, die durch den Perlenentfernungsalgorithmus aus dem gesamten Rohdatenbild identifiziert wurden (magentafarbene Kreise). Unten links: Gesamtrohdaten überlagert mit Lokalisierungen, die die Entfernung von Bead-assoziierten Lokalisierungen zeigen. Unten in der Mitte: eine 4-nm/Pixel-Darstellung von Lokalisierungen mit Bead-Reinigung. Diese Lokalisationen sind mit der AF647-Fluoreszenz verbunden. Unten rechts sind binäre AF647-Lokalisierungen mit PIEZO1-Kandidatenmolekülen, die die Anforderungen für den nächsten Nachbarn erfüllen, hervorgehoben durch cyanfarbene Kästchen. Maßstabsbalken = 20 µm. c: Die ersten 150 segmentierten, dreifach markierten PIEZO1-Partikel, die durch den Segmentierungsalgorithmus identifiziert wurden, erfüllen sowohl die Anforderungen an den nächsten Nachbarn als auch an den Abstand zwischen den Lokalisierungen. Jedes Partikel wird in einem 40 x 40 nm großen cyanfarbenen Begrenzungsrahmen angezeigt. d, Überblick über jeden der drei Hauptschritte im Partikelfusionsalgorithmus von Heydarian et al.28. e, Die Gesamtzahl der Lokalisierungen pro identifiziertem dreifach markiertem PIEZO1-Partikel aus allen iPALM-Datensätzen (n = 5 abgebildete Zellen, n = 726 identifizierte Partikel, n = 8500 Gesamtlokalisierungen). f, Eine 2D-Dichtegitterschätzung des in Abb. 1c gezeigten iPALM-Superteilchens unter Verwendung eines 1x1-nm-Gruppierungsgitters und gefärbt nach lokaler Dichte.

Quelldaten

a, links, iPALM-Superpartikel mit dreifacher Symmetrieerzwingung, basierend auf bekannter Kanalstöchiometrie, wie in Abb. 1c gezeigt (n = 5 abgebildete Zellen, n = 726 identifizierte Partikel, n = 8500 Gesamtlokalisierungen). Mitte, k-bedeutet die Anhäufung von Klingenpositionen, wie in Abb. 1d gezeigt. Rechts: Streudiagramm der durchschnittlichen Abstände zwischen den Rotorblättern pro Standort, wie in Abb. 1e dargestellt. Der wahrscheinlichste Abstand zwischen den Klingen wurde mit 25,4 ± 5,9 nm berechnet, verglichen mit 19,2 nm, die mit dem AlphaFold II-Modell an Position 103 berechnet wurden. Die Abstände werden als Mittelwert ± sd b, Links, iPALM-Superteilchen ohne Symmetrie unter Verwendung desselben angezeigt Datensatz wie für (a). Die Anzahl der Lokalisierungen pro Molekülposition ist nicht einheitlich. Da der Registrierungsalgorithmus dazu neigt, Regionen mit dichter Lokalisierung abzugleichen, führt dies zu einem „Hot Spot“ von Lokalisierungen28,29. Mitte, k-bedeutet die Clusterbildung der beiden dichtesten Lokalisierungsregionen. Das Superteilchen auf der rechten Seite wurde vor der Clusterbildung auf eine lokale Dichte von 2,75 × 10−5 begrenzt. Rechts, Streudiagramm der durchschnittlichen Abstände zwischen den Rotorblättern pro Standort. Der wahrscheinlichste Abstand zwischen den Rotorblättern wurde mit 25,0 ± 2,4 nm berechnet, verglichen mit 19,2 nm, die mit dem AlphaFold II-Modell an Position 103 berechnet wurden. Die Abstände werden als Mittelwert ± Standardabweichung angezeigt

Quelldaten

a, Streudiagramm der Abstände zwischen den Klingen an Aminosäureposition 103 mit (grüne Kreise, n = 30 Moleküle, n = 3 Zellen) und ohne (graue Kreise, n = 41 Moleküle, n = 5 Zellen) Anreicherung der Plasmamembran mit 300 µM Margarinsäure. Kolmogorov-Smirnov: P = 0,2030 und D = 0,2569. Die Abstände werden als Mittelwert ± Standardabweichung b, Varianz und 95 %-Konfidenzintervall der durchschnittlichen Abstände zwischen den Schaufeln an Position 103 mit und ohne Margarinsäureanreicherung aus den Streudiagrammdaten in (a) angezeigt. F-Test der Varianzgleichheit: P = 0,0012, F-Statistik = 3,10). c, Histogramm des Gaußschen Mischungsmodell-Anpassungsfehlers für alle identifizierten dreifach markierten PIEZO1-Moleküle an Position 103 mit (grün) und ohne (grau) Margarinsäureanreicherung. Bin-Breite = 1 nm. d, Oben: Histogramme der Winkel zwischen den Klingen für identifizierte dreifach markierte PIEZO1-Kanäle an Position 103 ohne Anreicherung (56,4 ± 27,8 nm, R2 = 0,84) und mit Margarinsäureanreicherung (57,1 ± 28,4 nm, R2 = 0,71). Die Winkel zwischen den Schaufeln wurden um 10 nm gruppiert und mit einer Gaußschen Funktion angepasst. Die Werte sind Mittelwerte ± SD. Unten: Streudiagramm der Änderung der Winkel zwischen den Schaufeln gegenüber der Symmetrie (60°). Mann-Whitney: P = 0,9097, U = 5484. Fehlerbalken werden als Median und 95 %-Konfidenzintervall angezeigt. Alle statistischen Tests sind zweiseitig.

Quelldaten

Histogramme der Abstände zwischen den Klingen für jede Kante des Dreiecks, das durch Fluorophorpositionen isolierter dreifach markierter PIEZO1-Moleküle gebildet wird, und die Verhältnisse jeder dieser Kanten. a, Abstände zwischen den Klingen und Kantenverhältnisse für TCO*K 103 ohne Reiz (aus Abb. 2e). b, Abstände zwischen den Schaufeln und Kantenverhältnisse für TCO*K 103 mit einem hypotonischen Schockreiz von 120 mOsm (aus Abb. 4b). c, Abstände zwischen den Klingen und Kantenverhältnisse für TCO*K 670 ohne Reiz (aus Abb. 3c).

Quelldaten

PIEZO-Proteinsequenzen zur Berechnung der Bindungsenergie.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mulhall, EM, Gharpure, A., Lee, RM et al. Direkte Beobachtung der Konformationszustände von PIEZO1. Natur 620, 1117–1125 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-06427-4

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Eingegangen: 4. Februar 2023

Angenommen: 11. Juli 2023

Veröffentlicht: 16. August 2023

Ausgabedatum: 31. August 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-06427-4

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