Eine Pipeline zur Entdeckung bispezifischer Antikörper mit hohem Durchsatz

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 380 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bispezifische Antikörper (BsAbs) stellen eine neue Klasse der Immuntherapie dar, aber die Ineffizienz der aktuellen Entdeckung hat ihre breite klinische Verfügbarkeit eingeschränkt. Hier berichten wir über eine agnostische, einzelzellbasierte funktionelle Screening-Pipeline mit hohem Durchsatz, die Molekular- und Zelltechnik zur effizienten Erzeugung von BsAb-Bibliothekszellen umfasst, gefolgt von einer funktionellen Abfrage auf Einzelzellebene, um positive Klone und Downstream-Sequenzen zu identifizieren und zu sortieren Identifikation und Funktionscharakterisierung. Anhand eines bispezifischen CD19xCD3-T-Zell-Engagers (BiTE) als Modell zeigen wir, dass unsere Einzelzellplattform eine Screening-Effizienz mit hohem Durchsatz von bis zu eineinhalb Millionen Variantenbibliothekszellen pro Lauf besitzt und seltene funktionelle Klone bei geringem Aufwand isolieren kann Häufigkeit von 0,008 %. Unter Verwendung einer komplexen CD19xCD3 BiTE-exprimierenden Zellbibliothek mit etwa 22.300 einzigartigen Varianten, die kombinatorisch unterschiedliche scFvs, verbindende Linker und VL/VH-Orientierungen umfassen, haben wir 98 einzigartige Klone identifiziert, darunter extrem seltene (~ 0,001 % Häufigkeit). Wir haben auch BiTEs entdeckt, die neuartige Eigenschaften und Erkenntnisse zur Gestaltung variabler Präferenzen für die Funktionalität aufweisen. Wir gehen davon aus, dass unsere Einzelzellplattform nicht nur die Entdeckungseffizienz neuer Immuntherapeutika steigert, sondern auch die Identifizierung verallgemeinerbarer Designprinzipien auf der Grundlage eines tiefgreifenden Verständnisses der Wechselbeziehungen zwischen Sequenz, Struktur und Funktion ermöglicht.

Bispezifische Antikörper (BsAbs) stellen eine äußerst attraktive Klasse von Antikörpern und Immuntherapeutika dar, die ein großes Potenzial zur Behandlung vieler Erkrankungen, einschließlich Krebs und Autoimmunität, bergen1,2,3,4,5. Dabei handelt es sich um unnatürliche Biologika, die so konstruiert sind, dass sie zwei verschiedene Epitope entweder auf demselben oder auf unterschiedlichen Zielantigenen erkennen. BsAbs bieten einzigartige therapeutische Wirkungsweisen, wie z. B. die Aktivierung und Einbindung von Immunzellen, um Tumorzellen abzutöten und gleichzeitig auf zwei synergistische therapeutische Ziele zu wirken5,6,7,8. Daher können BsAbs im Hinblick auf Spezifität, Wirksamkeit, Toxizität und Arzneimittelresistenz überlegene therapeutische Vorteile gegenüber herkömmlichen monoklonalen Antikörpern (mAbs) aufweisen. T-Zell-aktivierende BsAbs (TABs) stellen die größte Unterklasse von BsAbs dar und machen über 50 % der präklinischen und klinischen Pipeline von BsAb aus9, einschließlich klinisch zugelassenem Blinatumomab (CD3xCD19), Tebentafusp-tebn (CD3xGP100), Mosunetuzumab (CD3xCD20) und Teclistamab ( CD3xBCMA)9,10. TABs können T-Zellen und Tumorzellen direkt zur Abtötung verbinden und haben ein großes Potenzial für die Behandlung vieler Krebsarten. Derzeit gibt es über 45 CD3-basierte TABs, darunter BCMAxCD3, Her2xCD3, CEAxCD3 und PSMAxCD3, die klinisch für die Behandlung von soliden und hämatologischen Krebsarten getestet werden1,6. TABs können in verschiedenen Formaten entworfen werden, einschließlich bispezifischer T-Zell-Engager (BiTEs), die tandemartig verknüpfte Single-Chain-Fragment-Variable-Fragmente (scFvs) verwenden, die auf ein T-Zell-Epitop und ein Tumorantigen sowie IgG der gemeinsamen leichten Kette in voller Größe abzielen Immunglobulinkonfiguration, bei der jede variable schwere Kette entweder auf einen T-Zell-Rezeptor oder ein Tumorantigen abzielt1,6.

Leider bleibt die Entwicklung therapeutischer BsAbs, einschließlich TABs, ein äußerst anspruchsvoller, langsamer und kostspieliger Prozess, der ihre klinische Verfügbarkeit für ein breites Spektrum von Krankheiten einschränkt. Wir führen diesen Engpass größtenteils auf die Komplexität und Ineffizienz der aktuellen BsAb-Erkennungsmethoden zurück. Der herkömmliche Arbeitsablauf zur BsAb-Entdeckung beginnt üblicherweise mit der Charakterisierung eines Pools von mAb-Bindern für zwei jeweilige Antigene oder Epitope. Dann wird eine Gruppe von mAbs ausgewählt, um BsAb-Varianten individuell zu entwickeln, indem zwei Antigen-bindende Domänen, die von jedem Eltern-mAb abgeleitet sind, durch Heterodimerisierung von Untereinheiten oder direkte genetische Fusion (z. B. BiTEs) verbunden werden11,12,13,14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23. Anschließend wird eine begrenzte Anzahl von BsAb-Varianten exprimiert, gereinigt und anschließend einzeln in einem Dual-Target-Bindungstest und/oder einem Funktionstest getestet, um positive Klone zu identifizieren. Bemerkenswert ist, dass die BsAb-Konstruktion zwar normalerweise mit zwei vorcharakterisierten Antigen-Bindern beginnt, deren Integration zu einem funktionellen BsAb jedoch viel schwieriger ist. Tatsächlich ist die Bindungsaktivität eines BsAb an seine Ziele nur eine Voraussetzung, die sich nicht immer in funktioneller Aktivität niederschlägt. Beispielsweise wurde Emicizumab (ein klinisch zugelassener BsAb zur Behandlung von Hämophilie A) durch einen „Brute-Force“-Ansatz entdeckt, bei dem etwa 40.000 Kandidaten einzeln exprimiert, charakterisiert und optimiert werden mussten11. Insbesondere bei TABs hängen die T-Zell-Aktivierung und die tumortötenden Funktionen der resultierenden BsAbs entscheidend von zahlreichen Faktoren ab, darunter der Epitopposition und dem Abstand zur Zellmembran24,25,26,27,28,29 sowie der Antigengröße und -dichte27,28,29 ,30,31,32,33,34,35,36, Antikörper/Antigen-Bindungsaffinität31,32,33,34,35,37,38 die Größe, Wertigkeit, Faltung, strukturelle Orientierung und Mechanik von BsAbs und die Linkerlänge und Flexibilität27,36,39,40,41,42. Obwohl allgemein bekannt ist, dass kleine Variationen in den Formaten und Eigenschaften von BsAbs entscheidende Faktoren für die Funktionalität sein können, sind die Beziehungen zwischen diesen Faktoren kompliziert, und derzeit gibt es kein allgemeines Designprinzip, das die BsAb-Funktion beeinflussen kann. In der Praxis stützt sich das Fachgebiet daher auf einen Versuch-und-Irrtum-Prozess, bei dem BsAbs empirisch entworfen und aus vorhandenen mAb-Bindern konstruiert werden und dann einzeln auf ihre Funktionalität hin bewertet werden müssen. Dieser herkömmliche Ansatz, der typischerweise eine Mikrotiterplatte und ein Liquid-Handling-System umfasst, ist voreingenommen und schränkt den BsAb-Entdeckungsdurchsatz, die Erfolgsrate und die Durchlaufzeit zur Identifizierung eines therapeutischen Leitfadens für die weitere Entwicklung erheblich ein.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine einzelzellbasierte BsAb-Funktionsscreening-Pipeline mit hohem Durchsatz (Abb. 1), die die Funktionen einer großen Anzahl einzelner BsAb-Varianten aus einer unvoreingenommenen Bibliothek direkt abfragen kann. Die Einzelzell-Pipeline integriert mehrere Module, darunter ein molekulares und zelltechnisches Modul zur effizienten Generierung von BsAb-Varianten-Zellbibliotheken und Reporterzellen, ein optoelektromechanisches Modul für tröpfchenbasiertes Einzelzell-Funktionsscreening zur Identifizierung und Sortierung gewünschter Zellen BsAb-Klone und ein nachgeschaltetes molekulares Analyse- und Validierungsmodul zur Bestimmung der Sequenzen und Funktionalität der BsAb-Kandidaten (Abb. 1). Im Kern nutzt die Einzelzellplattform ein auf Tröpfchenmikrofluidik basierendes System, um einzelne BsAb-produzierende Zellen mit gemeinsam eingekapselten Zellreportern zu kompartimentieren und abzufragen. Funktionelle BsAb-Klone werden in der Lage sein, Zellreporter zu aktivieren, um Fluoreszenz zu erzeugen, was die Erkennung und Sortierung „positiver“ Tröpfchen aus einer heterogenen Population ermöglicht. Bemerkenswert ist, dass wir innovative Multiplex-Orthogonal-Assay-Chemie, Mehrpunktdetektion und Tröpfchenindizierungsstrategie implementiert haben, um die Screening-Genauigkeit sicherzustellen. Anhand eines etablierten CD19xCD3 BiTE als Modellsystem beschreiben wir im Folgenden, wie jedes Modul in einem optimierten Arbeitsablauf aufgebaut ist. Wir haben gezeigt, dass unsere Einzelzellplattform eineinhalb Millionen Bibliothekszellen in einem einzigen Lauf aufnehmen kann, was einen um zwei bis drei Größenordnungen höheren Durchsatz als bei herkömmlichen Methoden darstellt (10–100 Sekunden an Klonen für die manuelle Handhabung von Mikrotiterplatten). Methoden oder Tausende bis Zehntausende von Klonen für Robotik-Flüssigkeitshandhabungssysteme). Unter Verwendung einer gespickten Bibliothek, die mit HEK293-Zellen hergestellt wurde, die menschliches CD19 in einem mit Lymphomzelllinien vergleichbaren Ausmaß exprimieren und ein funktionelles CD19xCD3-BiTE sezernieren, haben wir die analytische Leistung, einschließlich der Screening-Effizienz, charakterisiert und gezeigt, dass die Einzelzellplattform in der Lage ist, ≥1 Kopien zu isolieren eines seltenen funktionsfähigen Klons (0,008 % Häufigkeit) mit 95 % Sicherheit in einem einzigen Lauf. Unter Verwendung einer komplexen CD19xCD3-BiTE-Bibliothek mit etwa 22.300 einzigartigen Varianten, in der wir scFv-Binder kombinatorisch variierten, die verschiedene Epitope und Affinitäten, VL/VH-Orientierungen sowie Länge und Flexibilität von scFv-Verbindungslinkern umfassten, haben wir 98 einzigartige funktionelle Klone identifiziert, darunter äußerst seltene Klone (~ 0,001 % Häufigkeit) und Klone, die starre scFv-verbindende Peptidlinker tragen, die im Widerspruch zur herkömmlichen Meinung stehen. Die Sequenzanalyse sortierter Klone untersuchte außerdem die Präferenzen verschiedener Designvariablen hinsichtlich der Funktionalität und stellte fest, dass die Anordnungen CD19VL-VH–CD3VH-VL und CD19VH-VL–CD3VH-VL die am meisten bevorzugte Ausrichtung sind. Die Sequenzanalyse enthüllte außerdem die Sequenzzusammensetzung der CDRH3-Domäne bei der Auflösung einzelner Reste und identifizierte konservierte oder promiskuitive Aminosäurereste.

Das Schema zeigt die verschiedenen Schritte der Mikrofluidik-Plattform, die für die BsAb-Entdeckung verwendet wird, von der Probenvorbereitung (Reporterzelle und BsAb-Bibliothekszellen), Tröpfchenassay und Erkennung/Sortierung, gefolgt von der nachgeschalteten Einzelzell-PCR, Sequenzierung, Proteinexpression und funktionellen Validierung/Charakterisierung von sortierten Klonen.

Die strukturellen und kompositorischen Eigenschaften des BsAb-Designs haben einen erheblichen Einfluss auf ihre Funktionalitäten. Im Gegensatz zum Versuch-und-Irrtum-Ansatz, der bei herkömmlichen Methoden verwendet wird, können wir viele Struktur- und Zusammensetzungsvariablen (z. B. Affinität, Epitopposition, Linkerdesign und relative Orientierungen der bindenden Antikörpereinheiten) unvoreingenommen und ohne Vorkenntnisse kombinatorisch abfragen den hohen Durchsatz unserer Single-Cell-Plattform. In dieser Studie haben wir versucht, die Plattform unter Verwendung von CD19xCD3 BiTE als Modell zu entwickeln und zu validieren, da sie klinisch validiert und umfassend untersucht wurde (z. B. Blinatumomab), bevor wir ihren Nutzen in Zukunft auf andere BsAbs ausweiten. BiTEs bestehen aus Tandem-Einzelkettenfragmentvariablen (scFvs), wobei ein scFv an eine T-Zell-Rezeptor-Untereinheit (am häufigsten CD3\(\varepsilon\)) und das andere an ein Zielantigen (z. B. ein tumorassoziiertes Antigen) bindet. (Abb. 2a). Die beiden scFvs sind durch einen Peptidlinker verbunden. Jedes scFv umfasst eine VH- und eine VL-Domäne, die von mAb-Bindern abgeleitet sind und durch einen kurzen Peptidlinker verbunden sind. Durch die Interaktion von T-Zellen mit Tumorzellen in unmittelbarer Nähe mithilfe von BiTEs werden T-Zellen aktiviert, um Zytokine und apoptotische Faktoren (hauptsächlich Perforine und Granzyme) freizusetzen, die anschließend Tumorzellen abtöten können.

a Designvariablen, die für die CD19-scFvs, CD3-scFvs und den Peptidlinker, der die scFvs verbindet, abgefragt wurden. b Schematische Darstellung der Integration einer Einzelkopie-BiTE-Variante in den Landeplatz, der die HEK293-Zelllinie (HEK293_LP) beherbergt, mit einer promotorlosen BiTE-Gen-kodierenden Donor-Plasmidbibliothek. c Darstellung der Diversität von BiTE-Designmerkmalen, die durch Long-Read-Amplikonsequenzierung (PacBio SMRT) von PCR-amplifizierten BiTE-Genen aus genomischer DNA von BiTE-integrierten HEK293_LP-Zellen erhalten wurden, Verteilung der relativen Orientierung von scFvs (i), Verteilung von relativen CD3-scFvs (ii). ), Verteilung von CD19-scFvs (iii) und Verteilung von scFv-Verbindungslinkern (iv). Etwa 22.300 einzigartige BiTE-Sequenzen, die aus der Long-Read-Amplikonsequenzierung erhalten wurden, wurden zur Analyse der Verteilung der Designparameter (relative scFv-Ausrichtung, CD3-scFv-Typ, CD19-scFv-Typ und scFv-Verbindungslinkertyp) verwendet. Die zur Amplifikation integrierter BiTE-Gene verwendete genomische DNA-Matrize wurde aus 3 × 106 HEK_LPCD19/BiTE-Zellen erhalten, die aus einem n = 1-Integrationsexperiment erhalten wurden.

Unser Bibliotheksdesign umfasst mehrere Variablen, einschließlich der Auswahl von scFv, die auf verschiedene Epitope abzielen, scFv-Bindungsaffinitäten, Länge und Flexibilität von Linkern sowie Orientierung von scFvs, alles bekannte Determinanten der BiTE-Funktionalität (Abb. 2a). Für CD19-Binder wählten wir scFv-Sequenzen basierend auf mAb 4G7, mAb FMC63, mAb B43 und mAb Juno241 (in der Ergänzungstabelle 1 mit ihren Eigenschaften aufgeführt). mAb B43 ist die Basis von Blinatumomab43,44. mAb 4G7 und mAb FMC63 binden an ein konformativ ähnliches Epitop auf hCD19, unterscheiden sich jedoch von dem des B43-bindenden Epitops45. Während 4G7 und B43 Berichten zufolge ähnliche Affinitäten aufweisen, weist FMC63 eine mindestens eine Größenordnung höhere Affinität auf43,46,47,48. Es wurde gezeigt, dass Juno241 eine starke Bindung an CD1949 aufweist. In ähnlicher Weise haben wir auch vier CD3-mAb-Binder angepasst: OKT3, L2K, h38E4.v1 und TRX4 (in der Ergänzungstabelle 2 mit ihren Eigenschaften aufgeführt). L2K hat beispielsweise über 90 % Sequenzidentität mit OKT3 und erkennt das gleiche Epitop auf CD3\(\varepsilon\), unterscheidet sich jedoch in der Affinität um etwa das Hundertfache50,51. L2K ist die Grundlage des klinisch zugelassenen Blinatumomab-Moleküls43, während OKT3 und TRX4 als mAb-Formate zur Behandlung bestimmter Autoimmunerkrankungen kommerziell erhältlich sind52. TRX4 und h38E4.v1 haben eine höhere Affinität zu CD3 im Vergleich zu OKT3 und L2K43,51,53,54. Um die Bibliotheksvielfalt zu erhöhen, führten wir eine Site-Scanning-Mutagenese mit NNW-degenerierten Codons in der CDRH3-Region der CD19-scFv-Kandidaten durch (siehe Methoden). Für Peptidlinker, die die beiden scFvs verbinden, wählten wir flexible kurze und lange Linker basierend auf dem GGGGS-Motiv sowie starre kurze und lange Linker basierend auf dem EAAAK-Motiv (Ergänzungstabelle 3)55,56. Die theoretische Vielfalt unserer kombinatorischen Bibliothek, berechnet als Produkt aus der Anzahl unterschiedlicher CD19- und CD3-Varianten, der Anzahl der scFv-Verbindungslinker und der Anzahl unterschiedlicher VL/VH-Orientierungen, beträgt 47.880 (Ergänzungstabelle 4). Anschließend wird ein auf Säugetierzellen basierendes BiTE-Expressionssystem konstruiert, das diese vielfältige Bibliothek enthält (unten), um eine Input-BsAb-Variante exprimierende Zellbibliothek für die Einzelzell-Screening-Pipeline vorzubereiten.

Wir haben eine Screening-Strategie konzipiert, bei der Reporter-T-Zellen in Tröpfchen mit einer einzelnen BiTE-sezernierenden Zelle eingekapselt werden, die auch das Zielantigen von Interesse, menschliches CD19, auf der Oberfläche in Mengen exprimiert, die mit denen gewöhnlicher Lymphomzelllinien vergleichbar sind. Durch die Expression von CD19 und BiTE in derselben Zelle und nicht in zwei verschiedenen Zellen können wir aufgrund der Poisson-Verteilung57 eine angemessene Effizienz der Tröpfchen-Co-Einkapselung mit der Reporterzelle erreichen. Wir gehen davon aus, dass funktionelle BiTEs, die von den CD19-exprimierenden Zellen sezerniert werden, den Zelloberflächen-CD19- und TCR-CD3-Komplex auf den T-Zell-Reporterzellen vernetzen und ein optisch erkennbares Intra-Tröpfchen-Reportersignal erzeugen. Um sicherzustellen, dass wir das Intra-Tröpfchen-Reportersignal (Phänotyp) mit einer bestimmten BiTE-Sequenz (Genotyp) verbinden können, ist es entscheidend, dass von jeder CD19-exprimierenden Zelle nur ein Typ von BiTE-Variante exprimiert wird. Um dies zu erreichen, wollten wir eine auf Säugetierzellen (HEK293) basierende Expressionsplattform für eine BiTE-Variantenbibliothek entwickeln, bei der jede Zelle in der Bibliothek genetisch mit einem Landeplatz-Expressionsvehikel integriert ist, das jeweils eine einzelne Kopie für eine BsAb-Variante kodiert. HEK293 wurde hier teilweise aufgrund seiner einfachen Verwendung für die Expression im kleinen Maßstab sowie für die Produktion rekombinanter Proteine, einschließlich BsAbs, im großen Maßstab ausgewählt. Konkret haben wir eine im Handel erhältliche HEK293-Landeplatz-Elternlinie („HEK293_LP“) übernommen, die über eine integrierte „Landeplatz“-Komponente im Genom verfügt (d. h. eine einzelne BxB1-Rekombinase-attP-Anheftungsstelle im Safe-Harbor-Locus Hipp11 (H11). auf Chromosom 22 im menschlichen Genom)58. Die Kompatibilität dieser HEK293-Landeplatzlinie für eine effiziente Integration (bis zu 38 %) eines exogenen Gens von Interesse wird durch die Insertion des mCherry-Gens in den Landeplatz-Locus validiert (ergänzende Abbildung 1a).

Als nächstes haben wir eine Zielzelllinie vorbereitet, die menschliches CD19 und ein funktionelles CD19xCD3 BiTE exprimiert. Wir haben zunächst mithilfe von CRISPR-Cas9 in der HEK293_LP-Zelllinie59 eine CD19-Expressionskassette stabil in einen Safe-Harbor-Locus auf Chromosom 1 integriert. Anschließend selektierten wir klonal CD19-konstruierte HEK293_LPs auf CD19-Expressionsniveaus, die mit anderen Standard-CD19+-Zellen, einschließlich Raji, NALM-6 und SU-DHL-6, vergleichbar sind (ergänzende Abbildung 1b). Schließlich haben wir eine BiTE-exprimierende Zellbibliothek mit einer Größe und Diversität erstellt, die denen typischer Antikörper-Keimbahn-Allele und Epitope für ein bestimmtes Ziel entspricht. Zu diesem Zweck haben wir zunächst einen „Donor“-Plasmidbibliothekspool generiert, der kombinatorisch kombinierte BiTE-Varianten stromabwärts einer „attB“-Anheftungsstelle beherbergte (siehe Methoden). Die kombinatorischen Elemente zur Erstellung der Bibliothek wurden im vorherigen Abschnitt und in den Ergänzungstabellen 1–4 besprochen. Die BiTE-beherbergende Donorplasmidbibliothek wurde dann mithilfe einer Integrase-vermittelten Rekombination in den Landeplatz der HEK293_LPCD19-Zellen integriert, um eine BiTE-Expressionszellbibliothek (HEK293_LPCD19/BiTE) zu erhalten. Ein Schema der Integration des Spenderplasmids in die Landepad-Befestigungsstelle ist in Abb. 2b dargestellt. Nach der Integration gewährleistet die Antibiotikaauswahl die Anreicherung von in Einzelkopien der BiTE-Variante integrierten HEK_LPCD19/BiTE-Zellen. Genomische DNA aus BiTE-integrierten Zellen wurde selektiv mit BiTE-genspezifischen Primern PCR-amplifiziert und PCR-Amplikons wurden durch Long-Read-Amplikonsequenzierung (PacBio, SMRT) analysiert. Wir konnten ca. 22.300 einzigartige BiTE-Varianten in voller Länge erhalten, die in die Zellbibliothek von Säugetieren integriert wurden. Darüber hinaus haben wir auch eine gut verteilte Darstellung von Designparametern wie scFv-Klonen, Linkern und Orientierungen in den integrierten BiTE-Varianten bestätigt (Abb. 2c). Wir haben auch eine einzelne Kopie der Blinatumomab-integrierten HEK293_LPCD19-Zelllinie (HEK293_LPCD19/Blin) unter Verwendung des oben beschriebenen Integrase-vermittelten Ansatzes mit einem Spenderplasmid entwickelt, das eine Expressionskassette des Blinatumomab BiTE enthält, das die identischen Aminosäuresequenzen wie das von der FDA zugelassene Blinatumomab trägt. einschließlich des gleichen C-terminalen 6XHis-Tags. Wir verifizierten die Expression von Blinatumomab durch Durchflusszytometrie unter Verwendung einer intrazellulären Färbung der manipulierten Zellen mit einem Anti-His-Tag-Antikörper (ergänzende Abbildung 1c).

Das Herzstück unserer Einzelzellplattform ist das optoelektromechanische Modul für den tröpfchenbasierten Einzelzellassay (Abb. 1). Dieses Modul ist in der Lage, eine hocheffiziente Zellverkapselung, Zelltröpfcheninkubation (in dieser Studie außerhalb des Chips), eine empfindliche und effiziente Detektion lebender Zellen innerhalb eines Tröpfchens mithilfe von Photomultiplier-Röhren (PMTs) und eine hocheffiziente Tröpfchensortierung über fluoreszenzaktivierte Tröpfchen durchzuführen Sortieren mittels Dielektrophorese (DEP). Bemerkenswert ist, dass unsere Einzelzellenplattform innovative sequenzielle Mehrpunkterkennungen in Verbindung mit kinetischer Tröpfchenindizierung verwendet, wobei die Zweitpunkterkennung eine PMT oder eine serielle Tröpfchenbildgebung unter Verwendung einer Kamera verwenden kann, um eine räumliche Auflösung bereitzustellen. Wir haben gezeigt, dass einzelne Ziel- und Reporterzellen mit einem ausreichenden Wirkungsgrad von ~20 % (aufgrund der Poisson-Verteilung57) in gleichmäßige, stabile Wasser-in-Öl-Tröpfchen unter Verwendung eines Flussfokussierungsgeräts bei einem Durchsatz von 1000 s eingekapselt werden können Tröpfchen pro Sekunde. Die Tröpfchengröße (in dieser Studie verwendet 240 pL), die Zusammensetzung des Mediums und die Inkubationsbedingungen der Tröpfchen wurden so abgestimmt, dass sie häufig verwendete Zellen, einschließlich Jurkat, HEK293 und primäre T-Zellen, mit einer Lebensfähigkeit von ≥90 % über 9 Stunden aufnehmen (ergänzende Abbildung 2). ). Bemerkenswert ist, dass sich Ziel- und Reporterzellen basierend auf der Dichte des Mediums tendenziell am Boden eines kugelförmigen Tröpfchens absetzen, wo sie dann in physischem Kontakt stehen, um Interaktionen zu erleichtern. Intra-Tröpfchen fluoreszierende Partikel (Zellen oder Mikrokügelchen) können mit ca. 10 Sekunden nachgewiesen werden. 90 % Nachweiseffizienz (ergänzende Abbildung 3a, b), und die positiven Tröpfchen können selbst für Klone mit geringer Häufigkeit (<0,1 %) mit einem Sortierdurchsatz von 100 s–1000 Hz effizient sortiert werden. Als Demonstration zeigte die ergänzende Abbildung 3c beispielsweise eine effiziente Sortieranreicherung positiver Tröpfchen aus einem anfänglichen Tröpfchenpool mit 10 % positiven Tröpfchen, die ≥1 fluoreszierende Zelle enthielten. Die sortierten Tröpfchen können für nachfolgende molekulare Analysen und Validierungen einzeln in Mikrotiterplatten dosiert werden.

Eine wichtige Innovation unserer Einzelzellplattform ist die Möglichkeit, direkt nach Funktionalitäten zu suchen, die therapeutische Wirkungsweisen verleihen, um die Notwendigkeit zu umgehen, zuerst Bindemittel zu identifizieren und dann ihre individuellen Funktionen zu bewerten, wie es in herkömmlichen Tests erforderlich ist. Um gezielt nach funktionellen BiTEs zu suchen, die auf der T-Zell-Aktivierung basieren, verwendeten wir ein T-Zell-Reportersystem („Jurkat-ZsG“), das von der Jurkat-Zelle (E6.1) abgeleitet ist und das ZsGreen-Fluoreszenzprotein stromabwärts des TCR-Aktivierungswegs exprimiert, der durch a gesteuert wird Promotor mit 6-fachem Kernfaktor aktivierter T-Zellen (NFAT) transkriptionell ansprechender Elemente (TREs)60 zur Untersuchung der BiTE-vermittelten T-Zell-/Tumorzell-Interaktion und T-Zell-Aktivierung (Abb. 3a). Wir haben Jurkat-ZsG zunächst in einem Kokulturassay mit CD19+ Raji-Zellen in großen Mengen funktionell validiert, indem wir ein rekombinantes BiTE mit einer Sequenz verwendet haben, die mit der von Blinatumomab identisch ist, und konditioniertes Medium aus unserem konstruierten HEK293_LPCD19/Blin (ergänzende Abbildung 4a). Mithilfe dieses Bulk-Assays haben wir unsere HEK293_LPCD19/BiTE-Bibliothek, die funktionelle CD19xCD3-BiTE-Klone sezerniert, unter Verwendung von gereinigtem Überstand aus HEK293_LPCD19/BiTE-Zellen weiter validiert (ergänzende Abbildung 4b). Die durch Blinatumomab-BiTE vermittelte T-Zell-Reporteraktivierung zeigte eine hohe Aktivierungseffizienz (40 %) mit einer Falsch-Positiv-Rate von 1 % und eine schnelle Kinetik (Signal in 3 Stunden nachweisbar und Spitzenwert in 6–9 Stunden) in Tröpfchen (Abb. 3b, c). ). Diese Daten belegen, dass die durch BiTEs vermittelte T-Zell-/Zielzell-Interaktion funktionell und effizient in einem kompartimentierten Tröpfchenformat auf Einzelzellebene untersucht werden kann. In ähnlicher Weise haben wir ein zweites Jurkat-Reportersystem entwickelt und charakterisiert, das ein tiefrot fluoreszierendes Protein E2-Crimson („Jurkat-E2C“) exprimiert, das verwendet wurde, um die Genauigkeit des BiTE-Screenings zu verbessern und falsch positive Ergebnisse zu reduzieren. Der Reportersignalschwellenwert für die Sortierung wird typischerweise auf (µnegativ + 4σ) eingestellt, wobei sich µnegativ bzw. σ auf die mittlere Signalintensität und die Standardabweichung in unstimulierten Reporterzellen beziehen. Bemerkenswert ist, dass die Jurkat-Reporterzellen bei T-Zell-Aktivierung nur sehr wenig oder gar kein Perforin (einen wichtigen apoptotischen Faktor) exprimieren und daher die Zielzellen nicht abtöten, die somit für nachgelagerte Analysen abgerufen werden können61.

ein illustrativer Mechanismus der durch CD19xCD3 BiTE vermittelten T-Zell-Aktivierung im Tröpfchentest. RE-responsives Element. b Mikroskopische Bilder von aktivierten Jurkat-ZsG-Reporterzellen (die einen GFP-Reporter exprimieren) in Gegenwart von Raji-Zellen (CD19+) und einem rekombinanten Blinatumomab in Forschungsqualität in Tröpfchen; Maßstabsbalken, 100 µm. Grün, ZsGrünes Reportersignal; Rot, ein für Raji vormarkierter Zellverfolgungsfarbstoff. c Änderung der ZsGreen-Signalintensität in Jurkat-ZsG-Zellen, denen 100 ng/ml Blinatumomab zugesetzt wurde, ohne Raji-Zellen (i) und mit Raji-Zellen (ii) über 0–9 Stunden nach der Inkubation. Die ZsGreen-Intensität wurde für zufällig ausgewählte Tröpfchen (erhalten aus einem Einkapselungsexperiment) zu jedem Zeitpunkt quantifiziert. Die Daten für jeden Zeitpunkt werden als Streudiagramm mit \({{{{{\rm{mean}}}}}\,\pm {SD}}\) Fehlerbalken dargestellt.

Als nächstes charakterisierten wir den Durchsatz, die Screening-Effizienz, die Reproduzierbarkeit und die Falsch-Positiv-Rate unserer Single-Cell-BsAb-Erkennungsplattform mithilfe einer gespickten Bibliothek, die mit Blinatumomab hergestellt wurde, das HEK293_LPCD19/Blin exprimiert. Kurz gesagt, HEK293_LPCD19/Blin wurde in unterschiedlichen Verhältnissen von 0,003 bis 1 % in einen Pool von HEK293_LPCD19-Elternzellen gegeben. Jede aufgestockte Zellprobe wird zusammen mit den Jurkat-ZsG-Reporterzellen eingekapselt, um mithilfe eines Tröpfchenerzeugungsmoduls Testtröpfchen zu erzeugen, wobei (a) die durchschnittliche Anzahl der HEK293-Zellen pro Tröpfchen etwa 0,3 beträgt, wodurch sichergestellt wird, dass ≥96 % der Tröpfchen entweder Null enthalten oder eine Bibliothekszelle, und (b) ~78 % der Tröpfchen haben jeweils mindestens eine Reporterzelle, mit einer theoretisch maximalen Rate positiver Tröpfchen von etwa 31 %. Nach sechsstündiger Inkubation werden die Assay-Tröpfchen mit dem Kernmodul der Einzelzellenplattform erkannt und sortiert. Die wiederhergestellten HEK293CD19/Blin-Zellen werden durch Einzelzell-PCR (Erfolgsquote 75–80 %) und anschließende Sanger-Sequenzierung verifiziert. Insgesamt haben wir herausgefunden, dass pro Lauf und an einem einzigen Tag bis zu 1,5 Millionen Zellen effektiv gescreent werden können. Abgegebene Tröpfchen können direkt verarbeitet oder bei –80 °C für die Batch-Verarbeitung zu einem späteren Zeitpunkt für die nachgelagerte Molekularbiologie und Funktionsvalidierung gelagert werden.

Wir haben beobachtet, dass unsere Plattform mit den mit HEK293_LPCD19/Blin versetzten Zellproben in einer Gesamtzahl von 40 Versuchsläufen mit unterschiedlichen Dotierungsverhältnissen im Bereich von 0,003 % bis 1 % konsistent bis zu etwa 25–30 % aller Kopien von wiederherstellen kann dieser Klon innerhalb jeder der einzelnen Proben, angesichts der theoretischen Obergrenze der Wiederfindungsrate (p) von etwa 31 % (Abb. 4a). Mit aufgestockten Proben unterschiedlicher HEK293_LPCD19/Blin-Häufigkeit (bis zu 0,003 %) konnten wir bei jedem Durchlauf konsistent ≥1 Kopien des Klons gewinnen. Durch multiple Regressionsmodellierung (linear und 4- oder 5-Parameter-Logistik) wurde ein lineares Modell ausgewählt, das ein signifikantes R2 (0,34) mit einem p-Wert von 0,0002 aufweist und die statistischen Annahmen (z. B. stabile Restvarianz; Unabhängigkeit) erfüllt und Normalität der Residuen). Dargestellt ist das Vorhersagemodell mit einem 90 %-Konfidenzintervall (Abb. 4b). Mit diesem Vorhersagemodell wird die Screening-Effizienz (P), definiert als die Wahrscheinlichkeit, mindestens eine Kopie eines positiven Klons zu isolieren, durch eine Binomialwahrscheinlichkeit gegeben: P = 1 − (1 − p)N (Abb. 4c), wobei sich die Bernoulli-Wahrscheinlichkeit „p“ auf die Wiederherstellungsrate bezieht. Das Binomialmodell sagt voraus, dass unsere Plattform gut in der Lage ist, ≥ 1 Kopie jedes seltenen funktionellen Klons (so niedrig wie 80 Kopien in einer Million Zellen oder 0,008 %) mit einem Konfidenzniveau von 95 % zu isolieren.

ein Streudiagramm, das die beobachtete Wiederherstellungsrate im Vergleich zur Häufigkeit von HEK293_LPCD19/Blin in großen negativen Zellen (eine Million HEK_LPCD19) zeigt. Die Wiederherstellungsrate ist definiert als die Anzahl der isolierten Kopien dividiert durch die Gesamtzahl der Kopien, die ursprünglich einer Probe zugesetzt wurden. Jeder Datenpunkt („Punkt“) wird aus der Mischung von \(n=3\) analytischen Replikaten von aufgestockten Proben abgeleitet. Die durchgezogene rote Linie wird aus einer linearen Regression mit einer Standardabweichungsgrenze (gepunktete Linien) abgeleitet. b Prognostizierte Wiederherstellungsrate basierend auf einem linearen Regressionsmodell und seinem 90 %-Konfidenzintervall (R2 = 0,34; p-Wert = 0,0002; statistische Annahmen weitgehend erfüllt, z. B. stabile Restvarianz). c Vorhersage der Screening-Effizienz („P“), definiert als die Wahrscheinlichkeit, ≥1 Kopie eines positiven Klons aus einem Zellpool zu entdecken. Dieses Modell basiert auf einer Binomialwahrscheinlichkeit, wobei sich die Bernoulli-Wahrscheinlichkeit „p“ auf die vorhergesagte Wiederherstellungsrate im vorherigen Regressionsmodell bezieht, die einer ausgewählten Konfidenzuntergrenze entspricht (90 % durchgezogene rote Linie oder 95 % durchgezogene blaue Linie). .

Ein weiterer Schlüsselfaktor für ein effizientes Hochdurchsatz-Screening ist die Kontrolle der Falsch-Positiv-Rate (FPR), die sich auf die nachgelagerte Arbeitsbelastung und die Betriebskosten auswirkt. Reporterzellen weisen typischerweise ein bestimmtes Grundniveau an inhärenter, falsch-positiver Aktivierung auf. Die Hauptquelle der falsch-positiven Aktivierung scheint eine unspezifische oder tonische Signalübertragung zu sein, die teilweise auf ein Auslaufen des Promotors zurückzuführen sein kann. Für unser Screening legen wir normalerweise einen Sortierschwellenwert fest, der 0, 1–1% falsch positive Ergebnisse toleriert (ergänzende Abbildung 5a). Um die FPR zu reduzieren, haben wir eine orthogonale Assay-Chemie eingesetzt, bei der sowohl Jurkat-ZsG als auch Jurkat-E2C gemeinsam mit HEK293_LPCD19/BiTE eingekapselt sind und bei der nur die Tröpfchen mit doppelter Reporteraktivierung (sowohl ZsGreen als auch E2-Crimson positiv) sortiert werden . Solche orthogonalen Assay-Auslesungen haben sich als äußerst nützlich erwiesen, um die Falsch-Positiv-Rate drastisch auf <0,01 % zu reduzieren (ergänzende Abbildung 5b).

Als nächstes bewerteten wir die Leistung unserer Einzelzell-BsAb-Entdeckungsplattform für das funktionelle BiTE-Screening aus einer komplexen Bibliothek (HEK293_LPCD19/BiTE). Als interne Referenz wurden unsere positiven Kontrollzellen HEK293_LPCD19/Blin in HEK293_LPCD19/BiTE-Bibliothekszellen mit einer Häufigkeit von 0,1 % versetzt. Alle BiTE-exprimierenden Zellen wurden mit Zellverfolgungsfarbstoff (CellTraceTM Violet) (CTV) gefärbt. Wie zuvor beschrieben, werden die BiTE-exprimierenden Zellen zusammen mit Jurkat-Reporterzellen in Tröpfchen eingekapselt, sodass die durchschnittliche Anzahl BiTE-exprimierender HEK-Zellen 0,3 pro Tröpfchen betrug. Für dieses Experiment verwendeten wir eine 1:1-Mischung aus Jurkat-ZsG und Jurkat-E2C, um falsch positive Ergebnisse zu reduzieren. Die durchschnittliche Anzahl der Reporterzellen pro Tröpfchen betrug etwa drei. Jedes der „positiven“ Tröpfchen enthält eine Bibliothekszelle (CTV+, blauer Peak) und doppelte Reportersignale (Jurkat-ZsG und Jurkat-E2C, grüne und rote Peaks), nachdem die Tröpfchen etwa 6 Stunden lang inkubiert wurden (Abb. 5a, b). . Die Fähigkeit, mehrere verschiedene Signale im Multiplex-Verfahren abzufragen, ermöglicht es uns, die Falsch-Positiv-Rate (die aus tonischen Signalen und unspezifischer Aktivierung von Reporterzellen durch z. B. aggregierte BiTEs resultiert) zu reduzieren, um seltene Klone von optimaler Qualität zu erhalten. Jedes einzelne Tröpfchen wurde zunächst am ersten Erkennungspunkt gescannt (Abb. 1). Als ein Tröpfchen mit doppelten Reportersignalen (Jurkat-ZsG und Jurkat-E2C) und einem HEK293_LPCD19/BiTE-Bibliothekszellsignal (CTV) erkannt wurde (Abb. 5b), wurde das Tröpfchen in den Sortierkanal gezogen. Danach bewegte sich das sortierte Tröpfchen stromabwärts zum zweiten Detektionspunkt, um die Fluoreszenzsignale weiter zu bestätigen. Der zweite Erkennungspunkt kann eine PMT- oder serielle Tröpfchenbildgebung mit einer Kamera nutzen, um eine räumliche Auflösung zu liefern (Abb. 5b). Wenn das sortierte Tröpfchen am zweiten Erkennungspunkt die Schwellenwerte überschreitet, wird ein Ausgabemodul ausgelöst, um das einzelne sortierte Tröpfchen in ein PCR-Röhrchen zu verteilen. Die Signale jedes positiven Tröpfchens vom ersten und zweiten Detektionspunkt können mit der Nummer des PCR-Röhrchens abgeglichen werden, sodass die Signale nach dem Sortieren weiter analysiert werden können, um festzustellen, ob es sich bei den sortierten Tröpfchen um falsch positive Tröpfchen handelt. Die mehreren Erkennungspunkte und Indexierungsmethoden können die Falsch-Positiv-Rate weiter reduzieren und dadurch die Gesamtkosten für die nachgelagerte Analyse senken.

a Repräsentative Streudiagramme aus zwei unabhängigen Screening-Läufen, die erkannte Tröpfchensignale nach 6-stündiger Inkubation zeigen. Jurkat-ZsG- und Jurakt-E2C-Reporterzellen wurden ohne die BiTE-Bibliothekszellen (i) oder mit den BiTE-Bibliothekszellen (ii) gemeinsam eingekapselt. HEK293_LPCD19/BiTE wurde mit dem violetten Farbstoff CellTraceTM vormarkiert. Gating-Zonen und Aktivierungsraten werden ebenfalls angezeigt. b Repräsentative Tröpfchensignalprofile (PMT) und Bilder, die einer positiven Zelle (i) und einer negativen Zelle (ii) entsprechen: HEK293_LPCD19/BiTE-Zelle (CellTraceTM Violett, blau), eine aktivierte Jurkat-ZsG-Zelle (ZsGreen, grün) und eine aktivierte Jurkat-E2C-Zelle (E2-Crimson, rot). c Repräsentatives DNA-Agarose-Gelbild, das Einzelzell-PCR-Produkte aus einer Reihe isolierter CD19xCD3-BiTE-Klone zeigt. d Repräsentative Durchflusszytometriediagramme zur Massenfunktionsvalidierung von sieben wiederhergestellten BiTE-Klonen (erhalten aus zwei Screening-Läufen). Jurkat-ZsG-Reporterzellen wurden zusammen mit CD19+ Raji in Gegenwart eines Tag-3-Konditionsmediums kultiviert, das aus der 1-ml-Expression von Expi293FTM-Zellen gewonnen wurde, die mit Expressionsplasmiden des BiTE-Gens transfiziert waren. Nach 24-stündiger Inkubation wurden die Jurkat-ZsG-Reporterzellen mittels Durchflusszytometrie profiliert, um die Aktivierungsrate zu messen. Als Positivkontrolle wurde auch Blinatumomab-BiTE transfiziert und parallel exprimiert. Insgesamt 265 BiTE-Klone wurden mithilfe des Jurkat-ZsG-Reporteraktivierungstests auf Funktionalität getestet (hier sind nur sieben Klone dargestellt). e Geschätzte Häufigkeit ausgewählter sequenzverifizierter gewonnener BiTEs. Beachten Sie, dass die Klone 4 und 5 äußerst selten sind (~0,001 % Häufigkeit). Die Häufigkeitsschätzung basiert auf der jeweiligen Anzahl einzelner Klone in den NGS-Sequenzen, wobei davon ausgegangen wird, dass diese Klone während der Vorbereitung der NGS-Bibliothek proportional amplifiziert werden.

Wir haben in zwei unabhängigen Läufen insgesamt 1,5 Millionen BiTE-exprimierende Bibliothekszellen gescreent und jeweils sortierte positive Tröpfchen in einzelne PCR-Röhrchen verteilt. Bemerkenswert ist, dass die Einzelzellplattform HEK293_LPCD19/Blin (Positivkontrolle) in jedem Durchlauf konsistent wiederhergestellt hat, wobei wir die Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen zwischen HEK293_LPCD19-Zellen versetzt haben. Abb. 5a zeigt ein repräsentatives Screening-Experiment, bei dem 0,26 % positive Treffer bei einem niedrigen FPR von 0,008 % erkannt wurden. Abbildung 5b zeigt repräsentative PMT-Profile und Bilder, die einem positiven bzw. negativen Tröpfchen entsprechen, unter Verwendung unseres dreifarbigen Assays (CellTraceTM Violet+ ZsG+ E2C+). Anschließend führten wir eine nachgelagerte funktionale Charakterisierung der sortierten Kandidaten durch. Zu diesem Zweck subklonierten wir zunächst BiTE-Genfragmente, die durch genspezifische PCR von cDNA erhalten wurden, die aus jeder gut sortierten cDNA synthetisiert wurden, in Expressionsplasmide (siehe Methoden, ergänzende Abbildung 6). Abb. 5c zeigt ein repräsentatives Agarosegelbild eines PCR-amplifizierten Produkts aus cDNA repräsentativ sortierter Tröpfchen. Anschließend exprimierten wir BiTE-Klone in einer Expi293F-Kultur im 1-ml-Maßstab in einem 96-Well-Plattenformat. Zweihundertfünfundsechzig erfolgreich wiederhergestellte Klone nach Einzelzell-PCR und Expression wurden dann mithilfe unseres Reporterzelltests in einem herkömmlichen Massenformat in Gegenwart von Jurkat-ZsG-Zellen und Raji-Zellen funktionell validiert (eine repräsentative Teilmenge der Daten ist in dargestellt). Abb. 5d). Mithilfe dieses Assays haben wir bestätigt, dass unter den getesteten 265 Klonen 213 Klone echt positiv waren (entsprechend einer Wahr- und Falsch-Positiv-Rate von etwa 80 % bzw. 20 %), die dann einer Sequenzierung und weiteren funktionellen Charakterisierung einschließlich primärer T. unterzogen wurden Zellaktivierung und Abtötung von Tumorzellen. Zusätzlich zur erfolgreichen Isolierung des Blinatumomab-Analogs BiTE (einer internen Positivkontrolle) aus den komplexen Bibliotheksproben wurden 98 einzigartige CD19xCD3-BiTE-Sequenzen entdeckt. Beispielsweise sind zwei Klone (Klone 4 und 5) sehr selten (jeweils mit einer Häufigkeit von ~0,001 %) (Abb. 5e). Bemerkenswert ist, dass mehrere Klone, einschließlich der repräsentativen Klone 1, 2 und 6, einen starren Linker (AEAAAKA oder AEAAAKEAAAKA) enthalten. Dies ist eine ziemliche Überraschung, wenn man die gängige Meinung bedenkt, dass an der Schnittstelle zwischen scFv-Domänen im Allgemeinen ein flexibler Linker bevorzugt wird62. Zwei repräsentative Klone, 4G7VL-VH-GGGGS-hu38E4.v1VH-VL (Klon 5) und 4G7VL-VH-AEAAAKA-L2KVH-VL (Klon 6), mit einem kurzen flexiblen bzw. einem starren Linker, wurden mithilfe eines Primärteils weiter charakterisiert T-Zell- und Raji-Kokulturassay (Abb. 6a–d) und funktionell validiert für die Tumorabtötung mit einer Effizienz, die mit rekombinantem Blinatumomab vergleichbar ist (Abb. 6e). Klon 6 verstärkt eine ähnliche Aktivierung und ein ähnliches zytotoxisches Profil aus primären T-Zellen wie Blinatumomab. Auch hier verfügt Klon 6 über einen kurzen, starren Linker (AEAAAKA), über den bisher in funktionellen BiTE-Sequenzen nicht berichtet wurde (obwohl über starre Linker im multispezifischen DARPin-Design berichtet wurde63). Diese Daten zeigen, dass der hohe Durchsatz und die agnostische Natur unserer Einzelzell-Erkennungsplattform eine effiziente Isolierung seltener funktioneller BsAb-Klone mit einzigartigen Eigenschaften ermöglichen, die mit herkömmlichen Trial-and-Error-Methoden mit niedrigem Durchsatz ansonsten unmöglich wäre.

a Aktivierungsprofil von CD4 + T-Zellen (bewertet anhand des Prozentsatzes der doppelt positiven CD69 + CD25 + -Population) in Gegenwart von Raji-Zellen und gereinigten BiTE-Klonen in unterschiedlichen Konzentrationen. b Prozentsatz der PD-1-exprimierenden CD4+ T-Zellen in Gegenwart von Raji-Zellen und gereinigten BiTE-Klonen in unterschiedlichen Konzentrationen. c Aktivierungsprofil von CD8+ T-Zellen (bewertet anhand des Prozentsatzes der doppelt positiven CD69+ CD25+-Population) in Gegenwart von Raji-Zellen und gereinigten BiTE-Klonen in unterschiedlichen Konzentrationen. d Prozentsatz PD-1, der CD8+ T-Zellen in Gegenwart von Raji-Zellen und gereinigten BiTE-Klonen in unterschiedlichen Konzentrationen exprimiert. e Apoptose von Raji-Zellen in Gegenwart von Pan-T-Zellen (E:T = 10:1), isoliert aus Spender-PBMCs und gereinigten BiTE-Klonen in verschiedenen Konzentrationen, bestimmt durch Annexin V/7AAD-Färbung von Raji-Zellen. Die Daten werden als XY-Diagramme dargestellt und jeder Datenpunkt wird als Mittelwert von \(n=3\) Replikaten (im Fall von Klon 5 und Klon 6) für Pan-T-Zellen erhalten, die aus \(n=1\) Spender isoliert wurden PBMCs. \({{{{{\rm{Mittelwert}}}}}\pm {SD}}\) Fehlerbalken werden für jeden Datenpunkt aufgezeichnet. Im Fall von Blinatumomab stammen die Daten aus \(n=2\) Replikaten und Fehlerbalken werden nicht angezeigt.

Um die Verteilung der Designvariablen (die in der ursprünglichen Bibliothek gut verteilt waren, Abb. 2c) in den sortierten Klonen aufzuklären, die die Funktionalität von BiTE-Varianten ermöglichten, sequenzierten wir funktionelle BiTE-Klone auf der Grundlage des Bulk-Reporter-Assays unter Verwendung der direkten Sequenzierung von Bakterienkolonien mit BiTE genspezifische Primer und entdeckte 98 einzigartige Sequenzen (plus den mit einem Spike versehenen Blinatumomab-Klon). Interessanterweise gibt es nur zwei relative Ausrichtungen von CD19- und CD3-scFvs:

(CD19VL–VH–CD3VH–VL und CD19VH–VL–CD3VH–VL) waren in den sortierten Funktionskandidaten vertreten, was auf eine spezifische Orientierungspräferenz für Aktivität hinweist (Abb. 7a). Bemerkenswert ist, dass das klinisch zugelassene Blinatumomab die Ausrichtung (CD19VL–VH–CD3VH–VL) verwendet. Es ist möglich, dass andere relative VH-VL-Orientierungen, einschließlich CD19VL-VH-CD3VL-VH und CD19VH-VL-CD3VL-VH, strukturell ungünstig für die Bindung und/oder Expression sind64,65. Darüber hinaus stellen wir auch die Unterrepräsentation (6–8 %) von h38E4.v1 CD3 scFv und FMC63 CD19 scFv in der sortierten Funktionsbibliothek fest (Abb. 7a), obwohl sie in der Originalbibliothek signifikant vertreten sind. Insbesondere sehen wir in unserer sortierten Funktionsbibliothek kein funktionelles BiTE, das einen h38E4.v1-CD3-scFv und einen FMC63-CD19-scFv umfasst, unabhängig von Orientierung oder Linkertyp (Ergänzungstabelle 5). Die Unterrepräsentation von FMC63 CD19 scFv ist besonders überraschend, da es die Grundlage für zugelassene CAR-T-Therapien ist47,60,61, was impliziert, dass BiTE und CAR-T selbst bei demselben scFv unterschiedliche MOA verwenden, möglicherweise aufgrund von Unterschieden in der Expression oder Faltung zwischen ihnen lösliche Proteinform in BiTE und Zelloberflächenproteinform in CAR. Darüber hinaus muss noch der Zusammenhang der Unterrepräsentation von FMC63 CD19 mit dem Bindungsepitop oder der Bindungsaffinität bestimmt werden, da 4G7 CD19 scFv, das ein ähnliches Bindungsepitop auf CD19 wie FMC63 aufweist und eine fast zehnfach geringere Affinität als FMC6346,47 besitzt, bei vertreten ist ein Niveau von 36 % in der funktional sortierten Bibliothek. Diese beobachtete unterschiedliche Darstellung könnte möglicherweise auf die Proteinexpressionseffizienz verschiedener molekularer Formate aus Wirtszellen (HEK293) im Tröpfchenassay zurückzuführen sein, die in zukünftigen Arbeiten untersucht wird. Wenn dies zutrifft, könnte unsere Einzelzell-Entdeckungsplattform nicht nur die Funktionalität, sondern auch die „Entwickelbarkeit“ (z. B. effiziente Expression) von Kandidatenmolekülen im selben Test prüfen und so die nachgelagerte Arzneimittelentwicklung weiter beschleunigen. Wir werden insbesondere an der Bewertung interessiert sein, ob ein solches „Entwickelbarkeits“-Screening auf andere Formate mehrkettiger BsAbs in voller Länge (z. B. das IgG-Format) angewendet werden kann, die fehlgepaarte Moleküle produzieren können. Darüber hinaus sind die vier in der Bibliothek verwendeten Linkertypen in den sortierten Klonen gut verteilt. Auch hier sind starre Linker im Gegensatz zu bisher angenommenen gleichermaßen funktionell. Wir stellen außerdem fest, dass ein funktionelles Screening mithilfe der Single-Cell-Discovery-Plattform wichtige konservierte Reste in der CDRH3-Domäne identifizieren kann, die zur Aufrechterhaltung der BsAb-Funktionen erforderlich sind (Abb. 7b). Beispielsweise identifizieren wir Reste wie Y10 und Y11 auf B43 CDRH3, die Mutationen nicht zulassen und für die Funktionalität des BiTE entscheidend sind (Abb. 7b). Zusammenfassend deuten diese Daten darauf hin, dass unsere Single-Cell-Discovery-Pipeline, die mehrere Variablen auf kombinatorische Weise mit hohem Durchsatz abfragt, zum ersten Mal die Designprinzipien von BsAbs beeinflussen und die Beziehung zwischen BsAb-Sequenzen bei der Auflösung einzelner Reste und der daraus resultierenden Funktion aufdecken kann .

a Verteilung der relativen Orientierung von CD19- und CD3-scFvs (i), Verteilung von CD3-scFvs (ii), Verteilung von CD19-scFvs (iii) und Linkern (iv) in der funktionell aktiven sortierten Bibliothek. Die durch Sanger-Sequenzierung aufgeklärte Sequenz von 99 funktionellen BiTE-Klonen (98 einzigartige Klone + 1 Blinatumomab-Sequenz) wurde zur Analyse der Verteilung der Designparameter verwendet. b CDRH3-Zusammensetzung sortierter BiTEs mit einem 4G7 (i), B43(ii), JUNO241 (iii) oder FMC63 (iv) aCD19 scFv. CDRH3-Zusammensetzungen für jeden CD19-scFv-Typ wurden aus n = 34 4G7 mit BiTEs, n = 25 B43 mit BiTEs, n = 29 JUNO241 mit BiTEs und n = 8 FMC63 mit BiTEs analysiert. Drei Klone wurden aufgrund von Sequenzmehrdeutigkeiten in der CDRH3-Region von der CDRH3-Analyse ausgeschlossen.

Immuntherapeutika revolutionieren derzeit die Behandlung vieler Erkrankungen, darunter auch Krebs. BsAbs stellen aufgrund ihrer neuartigen Wirkmechanismen einen der am schnellsten wachsenden Teilbereiche der Immuntherapie dar. Allerdings hat die Ineffizienz des aktuellen Paradigmas der immuntherapeutischen Entdeckung die klinische Verfügbarkeit von BsAbs für ein breites Spektrum von Krankheiten eingeschränkt. Der herkömmliche Trial-and-Error-Ansatz, bei dem BsAbs empirisch entworfen werden und dann einzeln auf ihre Funktionalität hin bewertet werden müssen, ist im Allgemeinen voreingenommen, langwierig, zeitaufwändig und teuer. Die hier beschriebene Einzelzell-BsAb-Entdeckungspipeline unterscheidet sich in ihren Arbeitsprinzipien von herkömmlichen Methoden auf Mikrotiterplattenbasis, indem sie ein hochparalleles, unvoreingenommenes, einzelzellbasiertes Screening mit hohem Durchsatz verwendet, das therapeutisch relevante Funktionalitäten der Kandidatenmoleküle direkt abfragt . Unsere Plattform kann die Entwicklung einer immuntherapeutischen Pipeline beschleunigen, um möglicherweise mehr und bessere BsAbs schnell verfügbar und für Patienten erschwinglich zu machen, was durch die folgenden überlegenen Merkmale im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ermöglicht wird: (a) Anpassungsfähigkeit und Skalierbarkeit: Unsere Plattform ist agnostisch, was bedeutet, dass unabhängige BsAb-Formate dies können direkt auf Funktionalität überprüft, ohne dass vorherige Kenntnisse der BsAb/Antigen-Bindungseigenschaften erforderlich sind; (b) Durchsatz und Screening-Effizienz: Unsere Plattform kann Millionen einzelner BsAb-Klone pro Lauf aufnehmen, im Vergleich zu 10–100 Klonen (manuelle Mikrotiterplatten-Handhabungsmethoden) oder Tausenden–10.000 Klonen (Roboter-Flüssigkeitshandhabungssysteme) in konventionelle Methoden (d. h. 100- bis 1000-fache Steigerung des Durchsatzes); Ein höherer Durchsatz bedeutet, dass man mit einer viel größeren Bibliothek mit höherer Variantenvielfalt beginnen kann, was daher die Erfolgsquote bei der Gewinnung gewünschter Klone erhöht, einschließlich qualitativ hochwertiger Klone mit geringer Häufigkeit aus einem großen heterogenen Pool; (c) Schnelle Bearbeitungszeit: Mit Ausnahme von Übergängen (z. B. ausgelagerte NGS-Dienste) umfasst die geschätzte Bearbeitungszeit für wichtige Prozesse in einer BsAb-Entdeckungskampagne: (i) Bibliotheksvorbereitung: 5–6 Wochen (Wochen); und parallel dazu Vorbereitung/Validierung der Reporterzellen: 3–5 Wochen; (ii) 1–2× Screening-Läufe: 1–2 Tage; (iii) Downstream-Validierung für ≤96 Treffer: 3–4 Wochen. Der Gesamtprozess dauert in der Regel 8–10 Wochen, um 10.000–100.000 BsAb-Varianten abzufragen, im Vergleich zu ≥10–12 Wochen, die für 100–1000 BsAbs unter Verwendung eines hochentwickelten Liquid-Handling-Systems erforderlich sind. (d) Reduzierte Kosten: Unser Einzelzellassay wird in Tröpfchen im Sub-Nanoliter-Bereich durchgeführt und erfordert nur ein kleines Probenvolumen bei deutlich geringeren Kosten für Reagenzien und biologische Proben.

Andere Tröpfchen-Mikrofluidiksysteme66,67,68,69,70, Mikrowell-Assays71, Optofluidik72 und Mikrokapillararrays73 wurden bereits früher für die Antikörperentdeckung eingesetzt, aber sie arbeiten entweder mit bindungsbasierten Assays mit moderatem Durchsatz oder sind anderweitig auf andere Entdeckungsbereiche konzentriert nicht direkt auf BsAb anwendbar. In einer kürzlich durchgeführten Studie wurde ein einzelzellbasiertes funktionelles Screening eingesetzt, das jedoch mehrere Anreicherungsrunden erforderte74, während hier über Innovationen in der Einzelzell-BsAb-Entdeckungsplattform berichtet wurde, darunter der Aufbau einer Einzelvariantenbibliothek über ein modulares, ortsgerichtetes Landepad-System mit orthogonalem Multiplex Die Assay-Chemie sowie die Mehrpunktdetektion und Tröpfchenindizierungsstrategie ermöglichen es uns, falsch positive Ergebnisse zu minimieren und große Bibliotheken in einer viel größeren Tiefe und geringeren Häufigkeit (0,001 %) abzufragen. Wir haben gezeigt, dass unsere Plattform äußerst seltene Klone mit einzigartigen Eigenschaften entdecken kann, die mit herkömmlichen Methoden mit geringem Durchsatz, voreingenommenen Versuchen und Irrtümern sonst nicht zu ermitteln wären. Unser Reporter-Assay wird als „Ja-oder-Nein“-Assay verwendet, um funktionelle Klone für die weitere nachgelagerte Charakterisierung anzureichern. Zukünftige Arbeiten werden die Korrelation zwischen der Intensität des Reportersignals und der Wirksamkeit der getroffenen Moleküle bestimmen; Wenn der Reporter-Assay die Kandidaten anhand ihrer Wirksamkeit quantitativ „einstufen“ kann, wird diese Technologie die Entdeckungseffizienz weiter verbessern.

Strukturelle und kompositorische Parameter im BsAb-Design können jeweils die BsAb-Funktion auf subtile, aber integrale Weise beeinflussen. Unsere Tröpfchenindizierung könnte funktionelle und phänotypische Ergebnisse einzelner Treffer mit nachgelagerten Einzelzellgenetiken (z. B. BsAb-Sequenzen) verknüpfen. Da unsere Single-Cell-Discovery-Plattform außerdem gleichzeitig mehrere Designvariablen auf kombinatorische Weise mit hohem Durchsatz abfragen kann, können wir zum ersten Mal damit beginnen, die Designprinzipien von BsAbs zu entschlüsseln und ein tiefgreifendes Verständnis der Inter- Beziehungen zwischen Struktur und Funktion der BsAb-Sequenz. Wir erkennen an, dass die Analyse von 98 sortierten Klonen in der aktuellen Proof-of-Concept-Studie unzureichend ist, aber die Sequenz- und Funktionsbeziehung kann durch zusätzliche Experimente und einen großen Datensatz, der in Zukunft generiert werden soll, aufgedeckt werden. Wenn wir relevante Einblicke in diese Wechselbeziehungen gewinnen, könnten wir die Entwicklung von BsAbs und möglicherweise anderen Immuntherapeutika von einem Versuch-und-Irrtum-Prozess in eine rationale technische Praxis umwandeln. Während diese Pilotstudie nur zwei Moleküle aus den positiven Treffern hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die T-Zell-Aktivierung und Tumorabtötung charakterisieren konnte, planen wir, weitere Klone der CD19xCD3-BiTEs weiter zu untersuchen, die bei unserem komplexen Bibliotheksscreening entdeckt wurden, was möglicherweise zu mehr führen kann optimalere therapeutische Kandidaten als der Blinatumomab-Benchmark. Wir werden die Rolle und den Mechanismus starrer Linker, bevorzugte VL/VH-Orientierungen, die Bindungsaffinität und das Epitop von scFv, konservierte Reste und die Expressionseffizienz in der BiTE-Funktionalität weiter untersuchen. Zusätzliche einzelzellbasierte Funktionstests können den Nutzen unserer Plattformtechnologie weiter steigern, zu der auch Immunzell-Effektorfunktionstests gehören, die für die Zytokinsekretion, den Metabolismus und/oder die Tumorabtötung relevant sind. Eine solche vielschichtige Bewertung kann die Entwicklung von BsAbs erleichtern, die optimale therapeutische Funktionen für die klinische Umsetzung aufweisen. Unser auf einer Einzelzellplattform basierender BsAb-Ansatz stellt einen einzigartigen Ansatz dar, um stark nachgefragte, aber komplexe und anspruchsvolle Ziele wie Zelloberflächenrezeptoren mit mehreren Untereinheiten gezielt anzusprechen.

Um einen DNA-Bibliothekspool von BiTE-Varianten in einem „attB“ enthaltenden Donorplasmid zu erzeugen, haben wir zunächst eine Plasmid-DNA-Unterbibliothek aus orientierungsvertauschten CD19- und CD3-scFvs vorbereitet (Ergänzungstabelle 1, Ergänzungstabelle 6). Jeder Unterbibliothekskandidat wurde in den terminalen sechs Resten der N-terminalen und C-terminalen Teile der VH- und VL-Domänen normalisiert (Ergänzungstabelle 6). Als nächstes haben wir mithilfe definierter Primerpools, die mit „NNW“-Mutationen an jeder CDRH3-Position der CD19-scFvs entworfen wurden, CDRH3-Varianten jedes Unterbibliothekskandidaten im CD19-scFv-Unterbibliothekspool (CD19-NNW-Unterbibliothek) vorbereitet. Primersequenzen, die für NNW-Mutationen in jedem Rest von CDRH3 von CD19-scFvs kodieren, sind in der Ergänzungstabelle 7 dargestellt. Als nächstes stellten wir einen Basisplasmidvektor her, der eine multiple Klonierungsstelle (MCS) aufwies, die aus EcoR1- und Kpn1-Restriktionsstellen bestand, die zwischen einer Signalsequenz eingebettet waren ( 5'- ATGGGCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTGGTGGCCACAGCCACAGGCGCCTATGCT-3') und Histag-2A-Sequenz (5'-CACCACCACCATCACCATGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCT-3'). Der Basisplasmidvektor hatte zusätzlich eine HindIII-Restriktionsenzym-Erkennungsstelle stromaufwärts der Signalsequenz und eine BamH1-Erkennungsstelle stromabwärts der Histag-2A-Sequenz, um die Extraktion der vollständigen BiTE-Expressionskassette (Signalsequenz-BiTE-Gen-Histag-2A) zu ermöglichen. Verwendung einer Gruppe von 16 ssOligos (Linker-Oligos) zur Kodierung der viergliedrigen Linker-Bibliothek (Ergänzungstabelle 3, Ergänzungstabelle 8) mit geeigneten Annealing-Enden, um alle vier möglichen relativen Ausrichtungen von CD19- und CD3-scFvs und vier zusätzlichen Oligos zum Annealing zu berücksichtigen Zu den normalisierten N-terminalen und C-terminalen Resten von VH- oder VL-Domänen amplifizierten wir mittels PCR die CD3-Varianten aus der CD3-scFv-Unterbibliothek sowie CD19-Varianten aus der CD19-NNW-scFv-Unterbibliothek. Die für die PCR von CD19-Varianten aus der CD19-NNW-scFv-Unterbibliothek und die PCR von CD3-Varianten aus der CD3-scFv-Unterbibliothek verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 8 aufgeführt. Nach der Gelreinigung und Quantifizierung wurden die PCR-Produkte in äquimolaren Verhältnissen gemischt und zusammengesetzt der oben beschriebene linearisierte Basisplasmidvektor unter Verwendung eines hauseigenen Gibson-Mastermixes. Konkret wurden 100 ng PCR-Fragmente mit 250 ng linearisiertem Plasmidvektor (EcoR1/Kpn1-verdauter Basisplasmidvektor) in 200 µL Gibson-Reaktion zusammengesetzt, in 220 µL DH5\(\alpha\)-kompetente Zellen transformiert und in 1 gewonnen ml SOC-Medium für 1 Stunde ohne Auswahl. Die 1 ml gewonnenen Kulturen wurden auf 30 ml TB-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin vergrößert. Aus der 30-ml-Kultur extrahierte DNA wurde mit HindIII-HF (#R3104S, New England Biolabs) und BamH1-HF (#R3136S, New England Biolabs) verdaut, und BiTE-Fragmente voller Länge (~1,6 kb) wurden unter Verwendung eines Agarosegels extrahiert Extraktion. Die gelgereinigten BiTE-Fragmente voller Länge wurden dann zu einem promotorlosen „attB“-Donorplasmid zusammengesetzt. Das promotorlose „attB“-Donorplasmid enthielt die Signalsequenz-(EcoR1/Kpn1)-MCS-Histag-2A-Puromycin-Kassette stromabwärts der „attB“-Bindungsstelle. Die Linearisierung des promotorlosen Donorplasmids mit den Restriktionsenzymen EcoR1/Kpn1 ermöglichte die Gibson-Assemblierung gelgereinigter BiTE-Fragmente im Leserahmen mit einer Signalsequenz und einer nachgeschalteten Puromycin-Sequenz. Darüber hinaus haben wir auch einen Blinatumomab BiTE-kodierenden „attB“-Donorplasmidvektor unter Verwendung von B43-kodierendem CD19-Unterbibliotheksplasmid, einer L2K-Sequenz kodierendem CD3-Plasmid und einem ssOligo, das einen kurzen „GGGGS“-Linker kodiert, und Annealing-Enden an VH-Cterm und VL-Nterm hergestellt. Die Sequenz des verwendeten Blinatumomab ist in der Ergänzungstabelle 6 dargestellt.

Wir haben HEK293-Zelllinien erhalten, die mit einer einzelnen Kopie der für die BxB1-Rekombinase spezifischen „attP“-Anheftungsstelle (HEK_LP) von Applied Stem Cell (#AST-1305, Applied Stem Cell) integriert sind. Wir haben unser selbst erzeugtes Cas9(pCas9)-Expressionsplasmid und gRNA-Plasmid (pGRNA) (spezifisch für die Integration in den Chr 1-Locus) mit CD19-Expressionsplasmid, das einen CAG-Promotor (pCD19) enthält, in die HEK293_LP-Zelllinien co-transfiziert. Das Massenverhältnis der Plasmide wurde bei 0,33:0,66:1 (pCas9: pGRNA: pCD19) gehalten. Die Transfektionen wurden mit Fugene® HD-Transfektionsreagenz unter Verwendung des Standardprotokolls des Herstellers durchgeführt. Konkret wurden 2 µg Gesamt-DNA in 1 × 106 Millionen HEK293_LP-Zellen transfiziert. Die Zellen wurden unter Verwendung von Hygromycin ausgewählt und die stabile Population wurde auf unserer Einzelzellplattform nach CD19-Expressionsniveaus sortiert, indem transfizierte Zellen mit dem Anti-CD19-Antikörper AlexaFluor® 647 (#302222, Biolegend) gefärbt wurden. Die Zellen wurden nach unterschiedlichen Expressionsniveaus von CD19 sortiert und klonale Zelllinien mit Expressionsniveaus, die mit denen von Standard-CD19-positiven Zelllinien wie Raji, NALM-6 und SUDH vergleichbar waren, wurden für nachgelagerte Experimente ausgewählt. Diese Zellen werden als HEK293_LPCD19 bezeichnet.

Insgesamt wurden 3 × 106 HEK293_LPCD19-Zellen mit 60 µg BxB1-Rekombinase-Expressionsplasmid (#AST 3201, Applied Stem Cell) und der oben beschriebenen BiTE-Gen-integrierten „attB“-Donorplasmidbibliothek im Verhältnis 1:3 transfiziert. Die Transfektion wurde mit dem Xfect-Transfektionsreagenz (#631318, Takara Bio) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Nach der Transfektion wurden die integrierten BiTE-Zellen 48 Stunden lang durch Selektion mit 1 µg/ml Puromycin angereichert und für die nachfolgende Tröpfchensortierung und das Screening oder den Massentest verwendet.

Insgesamt wurden 3 × 105 HEK293_LPCD19-Zellen mit 2,5 µg BxB1-Rekombinase-Expressionsplasmid (#AST 3201, Applied Stem Cell) und dem Blinatumomab-Gen-integrierten „attB“-Donorplasmid im Verhältnis 1:3 transfiziert. Die Transfektion wurde mit dem Xfect-Transfektionsreagenz (#631318, Takara Bio) gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Nach der Transfektion wurden die in Blinatumomab integrierten Zellen durch Selektion mit 1 µg/ml Puromycin für 48 Stunden angereichert und für die nachfolgende Tröpfchensortierung und das Screening oder den Massentest verwendet.

Genomische DNA wurde aus 3 × 106 HEK293_LPCD19/BiTE-Zellen mit dem Quick-DNA-Midiprep-Kit (#D4075, Zymo Research) extrahiert. Zur Amplifikation von BiTE-Varianten aus der genomischen DNA wurden genspezifische Primer verwendet, die sich an die Signalsequenz (5'-CTGGTCCTGCATCATCCTGTTTC-3') und die P2A-Sequenz (5'-GTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGG-3') anlagern. Die Amplifikation wurde mit 500 ng genomischer Template-DNA (entsprechend einer Genkopienzahl von 145.000) bei einer Annealing-Temperatur von 69 °C und einer Verlängerungszeit von 1 Minute und 30 Sekunden unter Verwendung der NEB Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (#MO491) durchgeführt , New England Biolabs Inc.). Die genomische Region, die durch PCR amplifizierte integrierte BiTE-Sequenzen enthielt, wurde gelgereinigt und durch Long-Read-Amplikonsequenzierung (PacBio, SMRT) analysiert. Die zirkulären Konsensus-Reads (~3 Millionen CCS-Reads) aus der Long-Read-Amplikonsequenzierung wurden mithilfe von Bioinformatikdiensten des Anbieters FornaxBio (Worcester, MA). Diese Gensequenzen wurden übersetzt und auf eindeutige und duplizierte Sequenzen analysiert. Die einzigartigen BiTE-Sequenzen wurden zusätzlich nach Linkertyp, VH-VL-Orientierung von CD19- und CD3-scFvs und Darstellung von scFv-Kandidaten sortiert. Die Sequenzanalyse wurde mithilfe von in R generierten Skripten unter Verwendung von Standardbibliothekspaketen (stringr, Biostrings) durchgeführt.

Für die Tröpfcheneinkapselung verwendeten wir eine Standard-Poisson-Verteilung (\({P}_{\lambda ,\,k}=\frac{{{e}^{-\lambda }\lambda }^{k}}{k! }\)) wobei \(\lambda\) die mittlere Anzahl der Zellen in einem Tröpfchen ist, k die Anzahl der Zellen in den Tröpfchen ist und \({P}_{\lambda ,k}\) die Wahrscheinlichkeit ist, dass a Tröpfchen enthält k Zellen, um die Verteilung von Zellen in Tröpfchen zu modellieren. Die Konzentration der Zellen wird auf der Grundlage des benötigten \(\lambda\) und der durchschnittlichen Größe der Tröpfchen (77 µm) berechnet. Wir haben zwei Screening-Läufe auf unserer Plattform durchgeführt. Eine Probe, die Jurkat-ZsG- und Jurkat-E2C-Reporterzellen enthielt, wurde im Verhältnis 1:1 ((\lambda =3)\) mit der anderen Probe, die HEK293_LPCD19/BiTE-Bibliothekszellen ((\lambda =0,3)\) enthielt, gemischt. wurden durch ein nicht mischbares Trägeröl unter Verwendung eines strömungsfokussierenden Tröpfchengenerators (hergestellt in einer Reinraumanlage an der UC Irvine) in Tröpfchen dispergiert. Das Trägeröl war fluoriertes Novec HFE7500-Öl (3 M) mit 2 % (Gew./Gew.) 008-Fluortensid (Ran Biotechnologies). Die HEK_LPCD19/BiTE-Zellen wurden mit CellTraceTM Violet (#C34571, ThermoFisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers vorgefärbt. Die Durchflussraten wurden so angepasst, dass Tröpfchen mit einem Durchmesser von etwa 77 µm erzeugt wurden. Die Tröpfchen wurden in einer Spritze mit Deckel gesammelt und 6 Stunden lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Tröpfchen erneut in einen anderen Mikrofluidikchip injiziert, um sie auf der Einzelzellplattform zu erkennen und zu sortieren. Die Einzelzellenplattform umfasst vier Laser mit den Wellenlängen 405, 488, 561 und 638 nm am ersten Detektionspunkt und zwei Laser mit den Wellenlängen 488 und 638 nm am zweiten Detektionspunkt. Die Fluoreszenzsignale der Tröpfchen wurden mithilfe von Photomultiplierröhren erfasst. Der Sortieralgorithmus wurde von LabVIEW programmiert. Wenn ein Tröpfchen die Schwellenwerte überschreitet, wird eine Hochspannung ausgelöst, um das Tröpfchen in den Sortierkanal zu ziehen. Das sortierte Tröpfchen bewegte sich stromabwärts zum zweiten Detektionspunkt, um die Fluoreszenzsignale doppelt zu bestätigen. Wenn das sortierte Tröpfchen am zweiten Erkennungspunkt die Schwellenwerte überschreitet, wird ein Ausgabemodul ausgelöst, um das einzelne sortierte Tröpfchen in ein PCR-Röhrchen zu verteilen. Die Peakprofile jedes aus PMTs erkannten Zieltröpfchens werden mit der Nummer des PCR-Röhrchens abgeglichen, das das Zieltröpfchen enthält, sodass die Peakprofile manuell überprüft werden können, um zu entscheiden, ob eine nachgeschaltete Analyse, d. h. Einzelzell-PCR, durchgeführt werden soll oder nicht. Diese Methode der Tröpfchenindizierung reduziert die Falsch-Positiv-Rate weiter und senkt die Gesamtkosten für die nachgelagerte Analyse. Alle Tröpfchen, die die Schwellen nicht passierten, wurden aus dem Abfallkanal entfernt.

Der Tröpfchenspender besteht aus einem maßgeschneiderten dreidimensionalen motorisierten Tisch, der eine Düse basierend auf einem Auslöser des Erkennungssystems von einem PCR-Röhrchen zu einem anderen PCR-Röhrchen bewegt. Wenn das Erkennungssystem einen positiven Tropfen erkennt und sortiert, wird ein interner Timer gestartet. Wenn das sortierte Tröpfchen den zweiten Erkennungspunkt im Sammelkanal passiert, wird der Zeitpunkt abgeglichen, und wenn das Tröpfchen innerhalb eines festgelegten Zeitrahmens eintrifft, sendet das Erkennungssystem einen einfachen digitalen Auslöser an das Abgabesystem. Beim Empfang des Signals bewegt der Spender die Düse von einem PCR-Abfallröhrchen zu einem PCR-Sammelröhrchen, das eine hypotonische Lösung von RNAsin (einem Enzym, das RNAse-Inhibitoren entfernt) enthält. Die einzelne Tröpfchenemulsion wird durch drei Einfrier- und Auftauzyklen aufgebrochen, und die enthaltenen Zellen werden aufgrund der hypotonischen Lösung einer osmotischen Lyse unterzogen und geben den RNA-Inhalt frei. Die Proben werden dann durch RT-PCR und cDNA-Amplifikation verarbeitet.

cDNA aus Zellen in den sortierten Tröpfchen wurde mit Gesamt-RNA synthetisiert und mit dem QIAGEN RNeasy Mini Kit (#74104, QIAGEN) extrahiert. Konkret haben wir Zufalls-Hexamer-Primer an 10 pg Gesamt-RNA angelagert, die aus einzelnen Zellen in einem 20-µL-Reaktionsmix extrahiert wurden, der 1 µL 50 µM Zufalls-Hexamer-Primer, 1 µL DNTP-Mix und 10 µL Gesamt-RNA enthielt. Die Glühreaktion wurde 5 Minuten lang bei 65 °C durchgeführt. Der angelagerte Primer und die Gesamt-RNA wurden mit 4 µL 5× SSIV-Puffer (#18090050B, ThermoFisher Scientific), 1 µL 100 mM DTT, 1 µL Ribonuklease-Inhibitor und 1 µL SuperScriptTM IV Reverse Transkriptase (#18090200, ThermoFisher Scientific) gemischt 10 Minuten bei 23 °C und dann 10 Minuten bei 55 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion 10 Minuten lang bei 80 °C inaktiviert. Amplifikation des BiTE-Gens aus der cDNA unter Verwendung von BiTE-Gen-spezifischem Vorwärts-PCR-Primer-Annealing an die Signalsequenz (5'-GCTGGTCCTGCATCATCCTGTTTCTG-3'), Anlagerung an die Signalsequenz und Reverse-PCR-Primer-Annealing an die 2A-Sequenz (5'-CCGGGGTTTTCTTCCACGTCTCC-3' ). Eine zweite verschachtelte PCR wurde mit einer Vorlage aus der ersten PCR durchgeführt, um die Spezifität der Produktamplifikation zu verbessern. Hierzu ein Vorwärts-Primer-Annealing an die Signalsequenz (5'-CTCGGTTCTATCGATTGAATTCCACCATGGGCTGGTCCTGCATCATC-3') und ein Reverse-Primer-Annealing an die Histag-Region (5'-TTGGGCCATGGCGGCCTTAATGGTGATGGTGGTGGTGCTTGATTTC-3'). Die Primer fügten dem PCR-Produkt außerdem terminale Restriktionsstellen (EcoR1 und HindIII) hinzu, um es für die Insertion in Expressionsplasmide zugänglich zu machen. 1 µL linearisiertes Expressionsplasmid wurde mit jeweils 3 µL PCR-amplifiziertem Produkt unter Verwendung von 4 µL NEBuilder HiFi DNA Assembly MasterMix (#E2621L, New England Biolabs) in einem 96-Well-Plattenformat zusammengesetzt. Die zusammengesetzten Genprodukte wurden direkt in 30 µL kompetenter XL1-Blue-Zellen transformiert und 30 Minuten lang in 200 µL SOC ohne Selektion in einem 96-Well-Plattenformat gewonnen. Die gewonnenen Bakterienzellen aus jeder Vertiefung wurden in 2 ml TB-Medium mit 100 µ\({{{\rm{g}}}/{mL}}\) Ampicillin für 12–16 Stunden bei 37 °C inokuliert. Nach der Inkubation über Nacht wurde die DNA mit dem ZymoPURE-Plasmid-Miniprep-Kit (#D4212, Zymo Research) und dem Protokoll des Herstellers aus den Bakterienzellen extrahiert. Die Konzentration jeder extrahierten DNA wurde quantifiziert.

Die sortierten BiTE-Kandidaten, die zu Expressionsplasmiden zusammengesetzt wurden, wurden dann in 1 ml Expi293FTM-Zellen (#A14527, ThermoFisher Scientific) unter Verwendung des ExpifectamineTM 293-Transfektionskits (#A14524, ThermoFisher Scientific) gemäß dem Protokoll des Herstellers in 96-Well-2-ml-Kulturplatten transfiziert. 72 Stunden nach der Transfektion wurde der BiTE-Überstand gesammelt und für den Bulk-Reporter-Aktivierungstest verwendet.

Zweiundsiebzig Stunden lang wurde BiTE-haltiger Überstand (oben beschrieben) mit 5 × 104 Jurkat-ZsG-Zellen und 5 × 104 Raji-Zellen für 24 Stunden in einer V-Bodenplatte mit 96 Vertiefungen gemischt. Die Zellen wurden dann mit PBS gewaschen und auf die Expression des zsGreen-Fluoreszenzproteins analysiert. Die Population aktivierter Jurkat-ZsG-Zellen wurde basierend auf der in der ergänzenden Abbildung 7 beschriebenen Gating-Strategie identifiziert.

Pan-T-Zellen wurden aus Spender-PBMCs (#70025, StemCell Technologies) unter Verwendung des EasySepTM-Isolierungskits für menschliche T-Zellen (#17951, StemCell Technologies) isoliert. 10.000 Raji-Zellen wurden mit 100.000 T-Zellen in Medien gemischt, die unterschiedliche Konzentrationen gereinigter BiTE-Klone (Klon 5 und Klon 6) enthielten. Nach 48 Stunden wurde die Hälfte der Zellen gesammelt und mit 7AAD (#50-850-582, Fisher Scientific) und Annexin V (#640906, Biolegend) sowie dem PE/Cyanin 7-Anti-Human-CD4-Antikörper (#317414, Biolegend) gefärbt ), APC/Cyanin 7 Anti-Human-CD8-Antikörper (#344714, Biolegend). Die Population von Annexin V+- und 7AAD+ Raji-Zellen wurde durch Ausschleusen von T-Zellen (CD4+/CD8+) erhalten (ergänzende Abbildung 8). Die andere Hälfte wurde mit einem Cocktail gefärbt, der 7AAD, PE-Anti-Human-CD69-Antikörper (#310906, Biolegend), FITC-Anti-Human-CD25-Antikörper (#356106, Biolegend), APC-Anti-Human-CD279-Antikörper (#329908, Biolegend) enthielt. PE/Cyanin 7 Anti-Human-CD4-Antikörper (#317414, Biolegend), APC/Cyanin 7 Anti-Human-CD8-Antikörper (#344714, Biolegend). Die vollständige Apoptose von Raji-Zellen wurde durch Gating für die 7AAD+- und Annexin V+-Population nach dem Gating von T-Zellen (CD4+ CD8+) erreicht. Der Prozentsatz an CD4+ CD69+ CD25+ T-Zellen, CD4+ PD-1+ T-Zellen, CD8+ CD69+ CD25+ T-Zellen, CD8+ PD-1+ T-Zellen wurde durch Gating für eine Subpopulation von reinen CD4+ T-Zellen und reinen CD8+ T-Zellen aus dem Leben erhalten (7AAD). −) T-Zellen (Ergänzende Abb. 9). Alle Antikörperkonzentrationen wurden in der vom Hersteller empfohlenen Konzentration verwendet.

BiTE-Expressionsplasmide, die funktionellen BiTE-Varianten entsprachen, wurden in XL1-Blue-kompetenten Zellen retransformiert und auf LB-Agar-Ampicillin (100 µg/ml) ausplattiert. Drei Kolonien pro BiTE-Kandidat wurden 6 Stunden lang bei 37 °C in 500 µl TB-Ampicillin (100 µg/ml) in 2-ml-Bakterienkulturplatten mit 96 Vertiefungen inokuliert. 100 µl der Kultur wurden in eine 96-Well-PCR-Platte pipettiert und für die RCA-Templatgenerierung und Sanger-Sequenzierung verwendet. Der Service für die Erzeugung von RCA-Templates und die Sanger-Sequenzierung wurde von ELIM Biopharm (Hayward, CA) bereitgestellt. Für die Sanger-Sequenzierung verwendeten wir das Annealing des Vorwärtsprimers (5'-AACATCCACTTTGCCTTTCTCTCC-3') an die Signalsequenz und das Annealing des Rückwärtsprimers (5'-GGACAAACCACAACTAGAATGCAG-3') an den Histag.

Zwei sortierte BiTEs mit jeweils kurzen starren und flexiblen Linkern (4G7VL–VH-AEAAAKA-L2KVH–VL und 4G7VL–VH-GGGGS-hu38E4.v1VH–VL) wurden aus einer 30-ml-Transfektionsskala exprimiert. Die BiTEs wurden aus konditioniertem Medium von Tag 3 gereinigt unter Verwendung des C-Terminus 6×His-Tags und Affinitätschromatographie mit immobilisiertem Metall (Cytiva, Nr. 29051021) auf dem ÄKTAExplorer100 FPLC-System (Cytiva). Nach der Elution mit einem Imidazol-Gradienten wurden die BiTE-Proteine ​​gepuffert, gegen PBS ausgetauscht und mit Amicon Ultra konzentriert -15 Ultrazentrifugationsröhrchen mit 10 kDa-Cutoff (Millipore Sigma, #UFC901096D).

Zur Quantifizierung der Reporteraktivierung in Tröpfchen in Gegenwart von Raji-Zellen und Blinatumomab-Antikörper wurde eine allgemein akzeptierte Probengröße von \(n=30\) verwendet. Um die Leistung unserer Pipeline zu bewerten, haben wir Blinatumomab-exprimierende HEK293_LPCD19-Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen in einen Pool von Blinatumomab-negativen HEK293_LPCD19-Zellen gegeben. Für dieses Experiment wurden \(n=3\) analytische Replikate der verschiedenen dotierten Proben verwendet. Regressionsmodelle wurden mit akzeptablem p-Wert (p = 0,0002) erstellt. Die Charakterisierung neu entdeckter BiTEs erfolgte mit \(n=3\) analytischen Replikaten. Daten zur Bewertung der Diversität der in die HEK293_LPCD19/BiTE-Zelllinie integrierten BiTE-Sequenzen stammen aus einem Integrationsexperiment, da wir nicht erwarten, dass sich die Effizienz der Integration auf die Diversität auswirkt. Zwei unabhängige Screening-Läufe wurden mit den Tröpfchen-Mikrofluidiksystemen mit hohem Durchsatz durchgeführt und beide Läufe ergaben ähnliche Leistungsmerkmale, was zur Identifizierung von 98 positiven BiTE-Treffern führte.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Unterstützende Daten sind in diesem Artikel als ergänzende Informationen verfügbar. Die zur Generierung der Zahlen verwendeten Rohdaten sind ebenfalls in den unterstützenden Informationen enthalten (Ergänzungsdaten 1). Weitere Datensätze, die während der aktuellen Studie erstellt und/oder analysiert wurden, sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

In dieser Studie wurde keine benutzerdefinierte Software oder Code verwendet.

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Diese Arbeit wird durch NSF/SBIR-Zuschüsse (#1913404 und #2051931) unterstützt. Wir danken Dr. Melanie Oaks (UCI Genomics High Throughput Facility) für hilfreiche Diskussionen zur Verarbeitung von NGS-Sequenzierungsdaten.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Aude I. Segaliny, Jayapriya Jayaraman, Xiaoming Chen, Jonathan Chong, Ryan Luxon.

Amberstone Biosciences, Inc., Irvine, CA, 92618, USA

Aude I. Segaliny, Xiaoming Chen, Jonathan Chong, Ryan Luxon, Audrey Fung, Qiwei Fu, Xianzhi Jiang, Rodrigo Rivera, Xiaoya Ma, Ci Ren, Yonglei Shang und George Wu

Abteilung für Biomedizintechnik, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Jayapriya Jayaraman, Per Niklas Hedde und Weian Zhao

Abteilung für Pharmazeutische Wissenschaften, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Jan Zimak & Weian Zhao

Sue und Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Weian Zhao

Chao Family Comprehensive Cancer Center, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Weian Zhao

Edwards Life Sciences Center für fortgeschrittene kardiovaskuläre Technologie, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Weian Zhao

Abteilung für biologische Chemie, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Weian Zhao

Institut für Immunologie, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Weian Zhao

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AS, YS, GW und WZ haben die Studie entworfen. XC, PNH, JC und QF entwickelten das Tröpfchen-Mikrofluidiksystem. YS, GW, AS, JZ und JJ haben die CD19xCD3 BiTE-Bibliothek entworfen. JJ, JZ und XJ erstellten die DNA-Bibliothek; JJ und AS entwickelten die Säugetierzellbibliothek, CD19+- und Blinatumomab+-Zellen. JC, AF, XC und AS führten die Spike-Experimente durch. JC, AF, XC, QF und AS führten das Bibliotheksscreening-Experiment durch. RL und JJ führten die nachgelagerte Analyse durch (scPCR, DNA-Gewinnung und Zusammenbau für die Expression, Sequenzanalyse, Expression im kleinen Maßstab). JJ und AS führten die funktionellen Validierungen sortierter Klone durch und JJ führte die Sequenzanalyse durch. AF und RR exprimierten und reinigten die BiTEs. AS, XM und CR führten die primären T-Zell-Assays für die sortierte BiTE-Validierung durch. AS, JJ, XC, GW und WZ analysierten die Daten und verfassten die Arbeit.

Korrespondenz mit George Wu oder Weian Zhao.

WZ ist Mitbegründer von Amberstone Biosciences, Inc. und Mitbegründer und leitender Angestellter von Aureka Biotechnologies, Inc. Die übrigen Autoren geben an, keine konkurrierenden Interessen zu haben.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Anam Akhtar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Segaliny, AI, Jayaraman, J., Chen, X. et al. Eine Pipeline zur Entdeckung bispezifischer Antikörper mit hohem Durchsatz. Commun Biol 6, 380 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04746-w

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Eingegangen: 20. Februar 2023

Angenommen: 22. März 2023

Veröffentlicht: 07. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04746-w

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